水稻抗白葉枯病基因Xa26和Xa4的遺傳和功能分析.pdf

1、白葉枯病是水稻中重要的病害之一,農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對于白葉枯病的防治主要利用抗病基因,水稻中鑒定了大量的抗白葉枯病基因,抗病基因的克隆將為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供抗源,同時對抗病基因功能的研究以及應用這些抗病基因有著重要的指導意義。
　　 水稻抗白葉枯病基因Xa26和Xa4都定位于水稻11染色體長臂的末端,Xa4是在中國水稻抗白葉枯病育種中應用較廣的基因,Xa26是在三系雜交水稻恢復系明恢63中鑒定的廣譜抗病基因。采用圖位克隆的策略分離克隆這兩個基

2、因具有重大的理論和應用價值。
　　 利用農(nóng)桿菌介導的轉化方法對Xa4和Xa26的候選基因進行穩(wěn)定的遺傳轉化,對轉化植株進行接種鑒定,確定基因。首先將Xa26的兩個候選基因MRKa,MRKb,利用其自身啟動子轉化到粳稻感病品種牡丹江8中,接種發(fā)現(xiàn)所有攜帶MRKb的轉基因植株都獲得了對白葉枯病的抗性,對其T1代植株接種表明所有抗性和轉基因的表型共分離,說明MRKb即為Xa26基因。牡丹江8背景的轉基因植株抗性相對于供體品種明恢63抗

3、性顯著提高,為了進一步研究粳稻背景對Xa26抗性的影響,將Xa26導入到另外兩個感病的粳稻品種中花11和02428中,結果發(fā)現(xiàn)這兩個背景下Xa26抗性也有明顯增強,并且由成株期抗性變?yōu)槿诳剐浴Ｒ陨辖Y果表明粳稻背景有利于Xa26發(fā)揮功能。為了更深入地了解Xa26的功能,利用玉米泛素啟動子在中花11和牡丹江8背景中超量表達Xa26,接種結果表明超量表達可以進一步提高抗性,并可以在一定程度上拓寬抗譜,而對于水稻生長發(fā)育并無明顯影響,預示

4、Xa26有著廣闊的應用前景。同時我們還利用一個病原誘導的啟動子在相同背景下表達Xa26,轉基因植株的抗性明顯減弱。這表明Xa26介導的抗性受到遺傳背景和表達強度的影響。
　　 利用定量PCR的方法分析不同背景下不同啟動子驅動的轉基因植株中Xa26的表達量,發(fā)現(xiàn)自身啟動子調控Xa26的所有轉基因植株表達量都明顯高于兩個秈稻品種明恢63和IRBB3,這說明Xa26在粳稻背景中的表達量明顯高于秈稻背景,表達量的升高可能是Xa26抗性增

5、強最直接的因為。為了進一步證明Xa26表達量與抗性的相關性,又在明恢63背景下超量表達Xa26,轉基因植株的抗性明顯增強。這些結果表明Xa26發(fā)揮作用具有明顯的劑量效應。
　　 Xa26在不同背景下在接種后的表達模式不同,在牡丹江背景轉基因植株中Xa26的表達有明顯的上升,而明恢63和IRBB3中卻有一個顯著的下降后再上升的趨勢,但中花11背景的植株沒有明顯的變化。同時分析了Xa26在不同生育期的表達量的變化,發(fā)現(xiàn)Xa26在苗期

6、表達量較低,而隨著生長發(fā)育的進行表達量逐步升高,在轉基因植株中也有相同的發(fā)現(xiàn),這個結果表明不同時期的表達量差異決定了不同時期的抗性差異。我們還發(fā)現(xiàn)Xa26的表達量的提高可以加快抗病反應下游基因OsWRKY13和NH1對白葉枯病菌的應答。這些結果說明了Xa26基因的表達受到生長發(fā)育的影響,并且Xa26表達量的提高可以影響下游基因的表達。
　　 采用超量表達的方法研究了Xa26家族成員MRKa和MRKc的功能,在中花11中超量表達M

7、RKa,轉基因植株表現(xiàn)為中等抗性；而MRKc的轉基因植株卻沒有獲得抗性,表明在抗病基因家族中一些成員會有抗性的殘留。構建了一個MRKa和Xa26的嵌合基因:Xa26LRR-TM-MRKaK,可以介導對白葉枯病的部分抗性,這說明通過人為的方法可以獲得新的抗病基因。同時對MRKa,Xa26,MRKc的表達模式研究發(fā)現(xiàn)三個基因的表達模式類似,并且基因表達部位都集中在維管組織周圍,說明抗病基因家族的表達模式在進化上有一定的保守性。并且白葉枯病是

8、一個維管病害,抗病基因在維管周圍的大量表達有利于其更好的發(fā)揮作用。
　　 利用RNAi技術抑制明恢63中Xa26的表達后植株抗性下降,而轉基因植株的生長發(fā)育并沒有受到明顯影響,表明抗病可能是Xa26基因的主要功能。
　　 此外在Xa4的研究中,將候選基因B4-RKa,TQ-RKa,TQ-RKb,TQ-RKd轉化到幾個水稻品種中都沒有獲得抗性,表明這幾個基因都不是Xa4,進一步分析發(fā)現(xiàn)還有一個基因可能是Xa4的候選基因:B