禽呼腸孤病毒S3、S4基因的克隆與序列分析.pdf

1、本試驗(yàn)提取禽呼腸孤病毒內(nèi)蒙古、天津地區(qū)分離株(B-98、C-98、G-98、T-98株)病毒總RNA。參考GenBank中禽呼腸孤病毒S3、S4基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)特異性地?cái)U(kuò)增病毒的S3、S4基因。將純化的目的DNA與PMDl9-T載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，應(yīng)用藍(lán)白斑法篩選陽性重組質(zhì)粒，然后用PCR法鑒定重組質(zhì)粒，將鑒定的陽性重組菌送生物工程公司測(cè)定S3、S4基因序列，應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件將測(cè)定序列與參考序列

2、進(jìn)行比較。結(jié)果表明測(cè)定的S3基因節(jié)段長(zhǎng)1202bp，均包含完整的開放性閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，位于31～1134 bp；S4基因節(jié)段長(zhǎng)1109bp，包含完整的開放性閱讀框(ORF)，位于2～1105 bp。禽呼腸孤病毒B-98、C-98、G-98和T-98的S3基因序列已成功登錄GenBank，登錄號(hào)分別為EF030498、EF030496、EF030497、EF030499。四個(gè)分離株的S3基因與禽呼腸

3、孤病毒S1133、176和雞源番鴨呼腸孤病毒YJL的同源性很高在99.2％～100％之間：與禽呼腸孤病毒138的同源性較高在87.0％～87.3％之間；與番鴨呼腸孤病毒S14和89026的同源性較低在60.0％～64.1％之間；與哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒3和納爾遜海灣病毒的同源性很低分別為3.8％和19.2％。四個(gè)分離株的S4基因與禽呼腸孤病毒S1133、176和雞源番鴨呼腸孤病毒YJL的同源性很高在98.8％～99.6％之間；與禽呼腸孤病毒

4、138和番鴨呼腸孤病毒S14和89026的同源性較高在76.4％～81.2％之間：與哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒3和納爾遜海灣病毒的同源性很低分別為6.5％～6.6％和53.9％～56.2％。S3和S4基因系統(tǒng)發(fā)生樹分析表明，均與禽呼腸孤病毒S1133,176和雞源番鴨呼腸孤病毒YJL的遺傳進(jìn)化關(guān)系最近，分屬同一進(jìn)化分支。天津、內(nèi)蒙古分離株的0 B蛋白和0 NS蛋白結(jié)構(gòu)分析表明，它們均為親水蛋白，等電點(diǎn)在6.27～7.10之間。天津、內(nèi)蒙古分離株