ACE2-Ang(1-7)-Mas軸調(diào)控的胰島內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)胰島β細(xì)胞的效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面展開論述:
　　第一部分 ACE2基因敲除加重高脂誘導(dǎo)的糖尿病前期小鼠胰島β細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞損害
　　目的：通過長期高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)糖尿病前期模型，觀察血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)基因缺失對糖尿病前期小鼠胰島β細(xì)胞及胰島內(nèi)皮細(xì)胞的影響。
　　方法：ACE2基因敲除小鼠及野生型C57小鼠均分為普通飲食(WT，KO)組和高脂飲食(WH，KH)組，喂養(yǎng)16周后,取四組小鼠胰腺行免疫熒光觀察小鼠胰島內(nèi)胰島

2、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31、Insulin的表達(dá)變化。免疫組化染色法檢測胰島內(nèi)VEGF、凋亡蛋白Caspase-3及氧化應(yīng)激標(biāo)志物iNOS的表達(dá)變化。分離純化小鼠胰島，RT-PCR法檢測胰島內(nèi)炎癥因子TNF-α及IL-1βmRNA的相對表達(dá)量。體外培養(yǎng)分離純化的KH組小鼠的胰島細(xì)胞團(tuán)，給予Ang(1-7)干預(yù)重建RAS平衡，觀察胰島細(xì)胞分泌功能的改變。
　　結(jié)果：在正常飲食條件下，與野生型小鼠（WT組）相比，ACE2基因敲除（KO組）

3、小鼠胰島內(nèi)胰島素相對含量(IRC)和胰島素陽性細(xì)胞核密度(ICD)無明顯的變化。與WT組相比，給予16周高脂飲食后， WH組小鼠胰島內(nèi)胰島素相對含量和胰島素陽性細(xì)胞核密度明顯減少（P<0.05)，同時伴隨胰島局部Caspase-3、iNOS表達(dá)增加（P<0.05)，胰島內(nèi)TNF-α及IL-1βmRNA表達(dá)增加（P<0.05)，提示高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病前期小鼠胰島功能受損，胰島局部炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)。與WH組相比，KH組小鼠胰島內(nèi)

4、胰島素表達(dá)進(jìn)一步減少（P<0.05)，胰島局部Caspase-3、iNOS及 TNF-α和IL-1βmRNA表達(dá)增加（P<0.05)，提示ACE2基因缺失加重了糖尿病前期小鼠胰島內(nèi)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，胰島功能一進(jìn)步受損。分離KH組小鼠的胰島，體外給予Ang(1-7)干預(yù)后，其GSIS功能改善（P<0.05)。
　　在正常飲食條件下，野生型小鼠（WT組）和ACE2基因敲除小鼠（KO組）胰島內(nèi)CD31陽性細(xì)胞表達(dá)無明顯改變。高脂飲食喂

5、養(yǎng)16周后，WH組CD31陽性細(xì)胞明顯增多（P<0.05)，VEGF表達(dá)增加（P<0.05)，提示糖尿病前期小鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞代償性增多。在高脂飲食條件下，與WH組相比，KH組小鼠胰島內(nèi)CD31陽性表達(dá)顯著減少（P<0.05)， VEGF表達(dá)減少（P<0.05)，提示ACE2基因敲除導(dǎo)致糖尿病前胰島內(nèi)皮細(xì)胞減少，胰島微循環(huán)失代償。
　　結(jié)論：ACE2基因缺失加重糖尿病前期小鼠胰島局部的應(yīng)激反應(yīng)，胰島內(nèi)皮細(xì)胞減少，胰島功能損害。

6、>　　第二部分 Ang(1-7)對胰島內(nèi)皮細(xì)胞系MS-1細(xì)胞功能的影響及機(jī)制研究
　　目的：探討Ang(1-7)干預(yù)上調(diào) ACE2-Ang(1-7)-Mas軸對生理及高脂培養(yǎng)條件培養(yǎng)的胰島內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響及保護(hù)作用。
　　方法：體外培養(yǎng)胰島內(nèi)皮細(xì)胞系MS-1細(xì)胞，給予Ang(1-7)干預(yù)后硝酸還原酶法檢測NO濃度的變化，Western blot檢測Akt-eNOS信號通路活性的改變。棕櫚酸及Ang(1-7)干預(yù)后檢測MS-

7、1細(xì)胞Akt-eNOS-NO信號通路活性的變化及細(xì)胞內(nèi)ROS的水平及凋亡改變。
　　結(jié)果：在生理條件下，與對照組相比， Ang(1-7)時間依賴性的增加 MS-1細(xì)胞內(nèi)Akt-eNOS-NO信號通路活性，表現(xiàn)為AKT、eNOS磷酸化水平增加（P<0.05），細(xì)胞生成NO增多（P<0.05），同時給予wortmannin或L-NAME干預(yù)后抑制了NO的生成（P<0.05）。Ang(1-7)在MS-1細(xì)胞中活化Akt-eNOS-NO通

8、路的效應(yīng)被A779阻斷（P<0.05），提示上調(diào)ACE2-Ang(1-7)-Mas軸后，MS-1細(xì)胞功能改善。
　　棕櫚酸培養(yǎng)24h后，MS-1細(xì)胞內(nèi)ACE2-Ang(1-7)-Mas軸下調(diào)，表現(xiàn)為ACE2及Mas受體表達(dá)均降低（P<0.05），而ACE-AngII-AT1軸活性增強(qiáng)，ACE及AT1受體表達(dá)增加（P<0.05）。與對照組相比，高脂組MS-1細(xì)胞內(nèi)Akt、eNOS磷酸化水平降低（P<0.05）， NO生成減少（P<0

9、.05），ROS產(chǎn)生增多（P<0.05），細(xì)胞凋亡增加（P<0.05）。與高脂組相比，高脂同時給予Ang(1-7)干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生減少（P<0.05），Akt、eNOS磷酸化水平增加，NO生成增多，MS-1細(xì)胞凋亡明顯下降（P<0.05）。而同時加入PI3K或eNOS特異性阻斷劑wortmannin或L-NAME后，Ang(1-7)抗脂性凋亡的作用被阻斷（P<0.05）。
　　結(jié)論：Ang(1-7)上調(diào)MS-1細(xì)胞內(nèi)Akt

10、-eNOS-NO信號通路活性，改善MS-1細(xì)胞功能。高脂條件下，Ang(1-7)通過上調(diào)Akt-eNOS-NO通路，拮抗ACE-AngⅡ-AT1軸活性，減少細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，改善MS-1細(xì)胞功能，減少脂性凋亡。
　　第三部分 Ang(1-7)介導(dǎo)的胰島內(nèi)皮細(xì)胞對高脂培養(yǎng)的β細(xì)胞系MIN6細(xì)胞的調(diào)節(jié)效應(yīng)及機(jī)制探討
　　結(jié)果與MIN6組相比，MIN6+PA組MIN6細(xì)胞的基礎(chǔ)胰島素分泌升高（P<0.05），而GSIS顯著降低（

11、P<0.05），Co-culture組GSIS有增加，但差異未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義。與MIN6+PA組相比，Co-culture+A組基礎(chǔ)胰島素分泌無顯著變化，但GSIS明顯改善（P<0.05），同時檢測到MIN6細(xì)胞內(nèi)胰島素mRNA表達(dá)增加。高脂培養(yǎng)后，MIN6細(xì)胞內(nèi)AKT磷酸化水平顯著降低（P<0.05）。與MIN6+PA組相比，Co-culture組AKT磷酸化水平增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，Co-culture+A組AKT磷酸化水平顯著

12、增加（P<0.05），提示Ang(1-7)可能通過MS-1細(xì)胞保護(hù)MIN6細(xì)胞內(nèi)胰島素信號通路免受高脂損害，改善其分泌功能。棕櫚酸干預(yù)后MIN6細(xì)胞的凋亡明顯增加（P<0.05），同時檢測到細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生顯著增加（P<0.05），P65蛋白表達(dá)增加（P<0.05），JNK、P38磷酸化水平上升（P<0.05）。與MIN6+PA組相比，Co-culture組MIN6細(xì)胞凋亡減少，ROS濃度及P65、JNK、P38的表達(dá)降低，而Co-cu

13、lture+A組凋亡率明顯降低（P<0.05），MIN6細(xì)胞內(nèi)ROS濃度及P65、JNK、P38的表達(dá)降低較Co-culture組進(jìn)一步降低，提示Ang(1-7)通過改善MS-1細(xì)胞功能，減輕高脂誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)，減少MIN6細(xì)胞脂性凋亡。
　　目的：體外以Ang(1-7)及Mas干預(yù)的不同狀態(tài)的胰島內(nèi)皮細(xì)胞與高脂干預(yù)的β細(xì)胞共培養(yǎng)，研究ACE2-Ang(1-7)-Mas通路介導(dǎo)的胰島內(nèi)皮功能對β細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)效應(yīng)。
　　方法

14、：體外建立共培養(yǎng)模型，棕櫚酸孵育48h的MIN6細(xì)胞與Ang(1-7)及Mas干預(yù)的MS-1細(xì)胞共培養(yǎng)，分組為：對照組（MIN6組）；棕櫚酸干預(yù)組（MIN6+PA組）；共培養(yǎng)(A分Co-culture組）；與Ang(1-7)孵育過的MS-1細(xì)胞共培養(yǎng)組（Co-culture+A組）；與ng(1-7)及A779孵育過的MS-1細(xì)胞共培養(yǎng)組（Co-culture+A+7組）。檢測MIN6細(xì)胞的泌功能，RT-PCR檢測胰島素mRNA的表達(dá)，D