藏花酸在Caco-2細(xì)胞模型中吸收機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　藏花酸（crocetin）屬于類胡蘿卜素物質(zhì)，具有不飽和共軛多烯酸結(jié)構(gòu)。藏花酸作為活血化瘀的中藥藏紅花的主要有效成分，研究表明其具有顯著的生物學(xué)效應(yīng)，現(xiàn)已越來(lái)越受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。藏花酸不僅常運(yùn)用于抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心律失常、抗高血壓等方面，還可以治療出血性休克作用，同時(shí)具有抗氧化和保肝利膽、降膽固醇等多重作用。藏花酸藥代動(dòng)力學(xué)方面的研究比較局限，有關(guān)文獻(xiàn)表明藏花酸在口服給藥后可以通過(guò)胃腸道吸收，吸收速度較快

2、但生物利用度較低，并且其吸收機(jī)制尚未見報(bào)道。
　　口服藥物在胃腸道的吸收分為簡(jiǎn)單擴(kuò)散、易化擴(kuò)散和主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，后兩者是需要轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的，P-糖蛋白即為其中一種轉(zhuǎn)運(yùn)體，其主要作用是阻止外源性物質(zhì)及對(duì)機(jī)體不利的代謝物經(jīng)腸道吸收，在藥物的吸收過(guò)程中有十分重要的意義。許多研究資料也已表明口服藥物的吸收受到P-糖蛋白外排作用的影響非常顯著，同為P-糖蛋白底物的藥物合用，會(huì)因其在P-糖蛋白水平的競(jìng)爭(zhēng)或抑制，而導(dǎo)致藥物發(fā)生吸收轉(zhuǎn)運(yùn)改變的報(bào)道屢見不鮮

3、。為避免口服藏花酸與其它藥物在體內(nèi)產(chǎn)生相互影響，展開藏花酸在胃腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究很有必要。Caco-2細(xì)胞模型是研究口服藥物吸收的體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，用于研究藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制，包括吸收機(jī)制和排出機(jī)制，目前在口服藥物進(jìn)入臨床應(yīng)用前的的初篩和研究藥物在腸道中的吸收的過(guò)程有廣泛應(yīng)用。因此，本課題利用Caco-2細(xì)胞模型研究藏花酸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及該藥與P-糖蛋白的關(guān)聯(lián)，為闡明藏花酸與P-糖蛋白底物合用是否會(huì)產(chǎn)生藥代動(dòng)力學(xué)方面的相互作用提供試驗(yàn)依據(jù)。

4、
　　目的：
　　利用Caco-2單層細(xì)胞模型模擬小腸吸收，通過(guò)考察時(shí)間、藥物濃度以及P-糖蛋白專屬抑制劑維拉帕米對(duì)藏花酸攝取轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，揭示藏花酸與P-糖蛋白的關(guān)聯(lián)性，以探索藏花酸的吸收機(jī)制。
　　方法：
　　1．建立生物樣品中藏花酸的HPLC檢測(cè)方法；
　　2.建立Caco-2細(xì)胞模型，并驗(yàn)證其完整性及緊密性；
　　3．分別考察時(shí)間、藥物濃度、P-糖蛋白抑制劑—維拉帕米對(duì)Caco-2細(xì)胞攝取藏花酸

5、的影響；
　　4．通過(guò)藏花酸在Caco-2細(xì)胞模型中的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)，研究藏花酸的轉(zhuǎn)運(yùn)是否由P-糖蛋白介導(dǎo)。
　　結(jié)果：
　　1、建立了生物樣品中藏花酸的HPLC檢測(cè)方法，并經(jīng)方法學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)藏花酸與內(nèi)標(biāo)吲哚美辛分離度良好，藏花酸在0.5～20μM的濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回收率、準(zhǔn)確度和精密度均滿足要求。該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，耐用性良好，能滿足細(xì)胞攝取及轉(zhuǎn)運(yùn)后的藏花酸濃度檢測(cè)的要求。

6、
　　2、觀察顯微鏡下的Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)情況，細(xì)胞形態(tài)良好，貼壁緊密；跨膜電阻隨著培養(yǎng)時(shí)間逐步增大，TEER值在培養(yǎng)21天后>500Ω·cm2；堿性磷酸酶活性在第3天未檢出，第15、21天檢測(cè)時(shí)已表現(xiàn)出堿性磷酸酶活性，第21天測(cè)出AP/BL的比值達(dá)到4.1倍，顯示已具有明顯的極化現(xiàn)象。結(jié)合以上各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)，證明該Caco-2細(xì)胞模型可用于后期的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。
　　3、藏花酸在Caco-2細(xì)胞中的攝取與時(shí)間及藥物濃度有關(guān)。

7、當(dāng)藏花酸初濃度為180μM時(shí)，其在Caco-2細(xì)胞中的攝取量在0~30min隨內(nèi)著時(shí)間而增加，30min之后基本達(dá)到穩(wěn)態(tài)。當(dāng)藏花酸初濃度在20-80μM時(shí)，其在Caco-2細(xì)胞中的攝取量和藥物濃度增加呈線性相關(guān)。藏花酸初濃度分別在10、20、40μM時(shí)，其攝取量比每組加入維拉帕米（60μM）后藏花酸攝取量略高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　4、藏花酸在Caco-2細(xì)胞模型的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示藏花酸在Caco-2細(xì)胞模型中

8、的吸收表觀滲透系數(shù)PappAP-BL為5.06×10-6cm·sec-1，PDR為1.52，說(shuō)明藏花酸在Caco-2細(xì)胞模型為中等吸收。在加入維拉帕米60μM后，對(duì)其PappAP-BL、PDR均無(wú)明顯影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。綜合以上結(jié)果表明藏花酸的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)與P-糖蛋白無(wú)關(guān)，它不是P-糖蛋白的底物。
　　結(jié)論：
　　藥物攝取轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)證實(shí)了藏花酸的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)可能存在雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，且不經(jīng)過(guò)P-糖蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。以上結(jié)果提示藏