亞洲棉NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的生物信息學(xué)分析及相關(guān)NAC基因的克隆和功能研究.pdf

1、棉花（Gossypium）是世界上最重要的經(jīng)濟作物之一，棉纖維是紡織工業(yè)的主要原料，棉花基因組序列圖譜的構(gòu)建為棉花的優(yōu)良品質(zhì)性狀、抗逆或抗病相關(guān)基因在整個基因組水平上的研究提供了重要資料，也為培育優(yōu)良品質(zhì)、抗逆或抗病的棉花新品種奠定了基礎(chǔ)。
　　轉(zhuǎn)錄因子是指那些具有真核啟動子特定DNA序列結(jié)合活性的蛋白質(zhì)分子，或者是指那些具有已知DNA結(jié)合域結(jié)構(gòu)特征的蛋白質(zhì)分子，其主要功能是激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在植物許多重要發(fā)育過程的調(diào)控網(wǎng)

2、絡(luò)中起著至關(guān)重要的作用。模式植物擬南芥中就有約5.9％的基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子在植物中廣泛大量存在并發(fā)揮重要作用，使其成為后基因組研究的一個重要領(lǐng)域。根據(jù)DNA結(jié)合域的不同，植物轉(zhuǎn)錄因子可分為很多家族，其中NAC((N)AM/(A)TAF/(C)UC)轉(zhuǎn)錄因子是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有多種功能的植物特有的轉(zhuǎn)錄因子。在植物體的生長發(fā)育和抗逆等許多生理過程中起著重要作用。目前，多種植物中的NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能已得到深入的闡述。
　　研

3、究發(fā)現(xiàn)，許多NAC轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥表皮細胞發(fā)育及莖次生壁形成中發(fā)揮重要的作用，由于棉花纖維細胞發(fā)育模式與擬南芥中纖維發(fā)育模式相似，因此為改善棉花纖維品質(zhì)研究，很多學(xué)者展開了NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究，并取得了一定成果，但是，迄今為止，棉花NAC基因的相關(guān)研究主要集中在陸地棉中，二倍體棉花中NAC基因研究報道相對較少，尤其是亞洲棉NAC轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)研究還鮮有報道，并且全面而詳細的對棉花整個NAC家族的研究也極少。
　　本研究通過生物信息學(xué)

4、分析方法從亞洲棉蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索并通過鑒定得到亞洲棉NAC轉(zhuǎn)錄因子基因家族的143個成員，然后對其進行結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進化、基因結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測分析;研究了棉花NAC基因在亞洲棉、陸地棉和雷蒙德氏棉各組織器官中的表達模式以及分析了其可能的進化關(guān)系，初步了解了棉花NAC轉(zhuǎn)錄因子潛在的重要功能。研究結(jié)果如下:
　　1.亞洲棉NAC家族基因的鑒定。基于亞洲棉基因組序列和亞洲棉29729條EST序列，并結(jié)合雷蒙德氏棉（Graimondii）NA

5、C轉(zhuǎn)錄因子家族的研究結(jié)果，利用生物信息學(xué)方法，鑒定出143個亞洲棉NAC基因。
　　2.亞洲棉NAC蛋白的系統(tǒng)進化分析。根據(jù)NAC結(jié)構(gòu)域的序列對NAC蛋白的系統(tǒng)發(fā)生進行分析，將亞洲棉NAC蛋白分為9個亞族。
　　3.基因重復(fù)在亞洲棉NAC基因家族的擴增中發(fā)揮了重要作用。基因結(jié)構(gòu)、基因染色體位置及在棉花基因組范圍內(nèi)對GaNAC基因進行的同源性分析表明基因重復(fù)可能在亞洲棉NAC基因家族的擴增和進化中發(fā)揮了重要作用，最終導(dǎo)致了Ga

6、NAC基因在數(shù)量上、結(jié)構(gòu)上和功能上的多樣性。
　　4.NAC轉(zhuǎn)錄因子表達模式分析及功能預(yù)測。利用實時熒光定量PCR技術(shù)對30個NAC轉(zhuǎn)錄因子在陸地棉和亞洲棉不同器官和不同發(fā)育時期的纖維組織中的表達模式進行分析，鑒定出7個在亞洲棉纖維細胞次生壁加厚期優(yōu)勢表達，進一步明確了它們在陸地棉、亞洲棉和雷蒙德氏棉三個棉種中的表達模式差異。初步預(yù)測了GaNAC基因在亞洲棉中的功能。
　　5.3個亞洲棉NAC基因的克隆。利用RT-PCR技術(shù)

7、克隆得到了3個NAC基因全長cDNA，將其命名為GaNAC20、GaNAC09和GaNAC69，初步的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GaNAC20和GaNAC09基因均含有3個外顯子和2個內(nèi)含子，GaNAC69含有4個外顯子和3個內(nèi)含子，為進一步研究奠定了良好基礎(chǔ)。
　　6.真核過表達載體構(gòu)建。為進一步研究GaNAC20、GaNAC09和GaNAC69基因的功能，我們將這3個基因分別與PBI121載體連接，置于35S強啟動子下游構(gòu)建了真核過表