PDX-1基因克隆載體的體外構(gòu)建.pdf

1、1:PDX-1基因克隆載體的體外構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建PDX-1基因的克隆載體,為真核表達載體的構(gòu)建及研究PDX-1誘導(dǎo)干細胞分化的作用機制提供基礎(chǔ)。
　　方法:采用Trizol方法從大鼠胰島細胞瘤細胞株中提取RNA,通過RT-PCR方法在體外擴增大鼠PDX-1 cDNA,瓊脂糖凝膠電泳鑒定,割膠純化后回收目的基因,與pMD-18T克隆載體連接構(gòu)建,經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切及DNA序列分析鑒定pMD-18T-PDX-1的正確構(gòu)建。

2、
　　結(jié)果:正確構(gòu)建了含有PDX-1 cDNA的克隆載體pMD-18T-PDX-1,其中PDX-1 cDNA全長為908bp。
　　結(jié)論:在體外成功克隆了PDX-1基因,并正確構(gòu)建了PDX-1基因克隆載體,對進一步進行PDX-1在真核細胞中的表達及研究PDX-1在干細胞定向分化中的作用具有重要的意義。
　　2:體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞向胰島素分泌細胞分化
　　目的:體外培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞,將間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)

3、分化為胰島素分泌細胞,探討誘導(dǎo)分化過程中干細胞向胰島素分泌細胞分化的潛能及功能變化趨勢。
　　方法:體外培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞,培養(yǎng)至貼壁80％,將間充質(zhì)干細胞分兩組, A組為誘導(dǎo)組,B組為對照組。A組先后予以1mmol/L2-巰基乙醇培養(yǎng)2天,10ng/ml表皮生長因子、10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子及2% B27培養(yǎng)7天,之后添加20mmol/L尼克酰胺及艾塞那肽培養(yǎng)7天。B組不添加試劑,繼續(xù)換液培養(yǎng)。通過觀察細胞形態(tài)變

4、化、RT-PCR體外擴增兩組細胞的PDX-1基因的cDNA、放射免疫法測定兩組細胞胰島素分泌量三種方法來鑒定胰島素分泌細胞。
　　結(jié)果:(1)通過形態(tài)學(xué)觀察,可見未分化的臍帶間充質(zhì)干細胞呈長梭形,分界清楚,傳代后細胞呈纖維樣生長,而 A組細胞逐漸變小,呈圓形,折光性變強,細胞聚集成團,類似胰島樣細胞,B組細胞仍呈長梭形,分界清楚,纖維樣生長;(2)RT-PCR: A組細胞可擴增出PDX-1基因的 cDNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,P