CCDC154基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控及其分子機(jī)制.pdf

1、目的:
　　 CCDC154是一個(gè)全新的功能基因。前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)CCDC154與石骨癥相關(guān)，但其具體的生物學(xué)功能目前仍不清楚。為了深入探討CCDC154基因的生物學(xué)功能，我們克隆人CCDC154基因，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究該基因的生物學(xué)特性、功能及其作用的分子機(jī)理。
　　 方法:
　　 1)從HEK293細(xì)胞中提取總RNA，利用RT-PCR技術(shù)克隆CCDC154編碼序列，利用生物信息學(xué)工具分析其結(jié)構(gòu);
　

2、　 2)構(gòu)建CCDC154真核表達(dá)載體，在HEK293及Hela細(xì)胞中瞬時(shí)或穩(wěn)定高表達(dá)CCDC154基因，利用克隆形成、MTT、軟瓊脂等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CCDC154在細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控中的作用。
　　 3)通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)，分析CCDC154基因調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)理。
　　 4)構(gòu)建不同的CCDC154基因缺失突變體，通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CCDC154調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)域。<

3、br>　　 結(jié)果:
　　 1)成功克隆了CCDC154編碼序列，長(zhǎng)2001 bp，編碼667個(gè)氨基酸。蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，CCDC154含有多個(gè)coiled-coil domain和周期蛋白結(jié)合域。
　　 2)在HEK293和Hela細(xì)胞中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)CCDC154顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。CCDC154過(guò)表達(dá)細(xì)胞形成的克隆數(shù)目明顯減少;MTT細(xì)胞活性測(cè)定顯示，CCDC154過(guò)表達(dá)細(xì)胞的生長(zhǎng)活性明顯降低。
　　 3)穩(wěn)定

4、過(guò)表達(dá)CCDC154顯著抑制HEK293和Hela細(xì)胞生長(zhǎng)，并且體外成瘤顯示，穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CCDC154明顯抑制Hela細(xì)胞形成的克隆大小。
　　 4)細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CCDC154導(dǎo)致HEK293細(xì)胞在G2/M期發(fā)生阻滯，G2/M期細(xì)胞數(shù)目提高兩倍以上。
　　 5) Western Blot結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)CCDC154導(dǎo)致HEK293細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin B1，Cdc2表達(dá)下調(diào)，p21、Chk1