人脂肪干細胞協(xié)同顆粒脂肪移植的實驗研究.pdf

1、目的:在體外特定的條件下，將人脂肪干細胞(ADSCs)擴增后混合人的顆粒脂肪，將其移植于裸鼠的背部筋膜下，研究并探討脂肪干細胞在脂肪移植中向脂肪細胞的分化以及促進血管再生的能力，同時探討移植物中干細胞與顆粒脂肪的最佳比例，為人脂肪干細胞在脂肪移植中的臨床應用提供進一步的理論依據。
　　方法:
　　1.脂肪干細胞的提取:無菌條件下提取人脂肪組織15g，磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗干凈以去除殘留血液，眼科剪和眼科鑷剔除脂肪組織中

2、可見結締組織和血管，剪碎至大小為3mm的細小顆粒，將其置于Ⅰ型膠原蛋白酶濃度為0.075％的PBS中，在37℃條件下震蕩消化30min，將消化液移入離心管，在800g離心力下離心10分鐘，100目篩網過濾離心管中沉淀物，所得細胞提取物用DMEM培養(yǎng)液（含10％的胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、5mg/ml肝素和2ng/ml酸性成纖維細胞生長因子）[1]重懸，以適當密度接種于無菌培養(yǎng)瓶中，在37℃、CO2體積分數為5

3、％、飽和濕度的孵箱內培養(yǎng)，48h后半量換液，以后每隔3d進行換液操作，當原代細胞基本長滿培養(yǎng)瓶底部時，用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液將貼壁的細胞消化，按照1∶3的比例進行傳代，接種于無菌培養(yǎng)瓶中，以后傳代均進行以上重復操作。同時使用流式細胞術對即將進行動物實驗的細胞進行表面抗原表達情況的分析。
　　2.Brdu標記脂肪干細胞:脂肪干細胞傳至第4代，加入終濃度為10μg/mL的Brdu，48h后檢測標記率。其余標記細胞經胰蛋白

4、酶消化后混合顆粒脂肪，進行動物實驗。
　　3.顆粒脂肪分離:從臨床手術中提取人類廢棄的脂肪組織，使用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)液沖洗，將殘留的血液去除干凈后，將顆粒脂肪剪碎至0.5～1mm3，置于50mL離心管中，加入適量的干細胞培養(yǎng)基(DMEM/F12)，在1200r/分的轉速下離心3分鐘，得到最終的顆粒脂肪。
　　4.對移植顆粒脂肪進行稱重:將顆粒脂肪剪碎離心后，放置于離心管中，對離心管中顆粒脂肪進行稱重，將實驗組分為A組

5、、B組、C組、D組共4組，分別加入第4代Brdu標記的脂肪干細胞，干細胞與顆粒脂肪比例依次為105∶500mg、3×105∶500mg、6×105∶500mg、9×105∶500mg，對照組為單純顆粒脂肪。1mL注射器稱重后抽取500mg顆粒脂肪。
　　5.顆粒脂肪移植:將含有ADSCs的500mg顆粒脂肪注射在裸鼠左側背部筋膜下，500mg單純的顆粒脂肪注射在裸鼠右側背部筋膜下。
　　6.移植顆粒脂肪的檢測:于移植后28天

6、時將裸鼠處死，取出背部移植顆粒脂肪，剝離掉移植物周圍包膜，放置于電子天平上稱重，并記錄。之后置于4％多聚甲醛中固定，對移植物進行石蠟切片，分別進行蘇木精-伊紅染色、內皮細胞標志物CD34的檢測以及BRDU抗體標記物的檢測。
　　結果:
　　1.脂肪干細胞(ADSCs)分離、培養(yǎng)及鑒定:細胞提取物經DMEM培養(yǎng)液重懸后，以適當密度接種于無菌培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)3-5天后可觀察到多角形細胞及梭形細胞，之后多角形細胞逐漸變形為梭形細胞。

7、
　　2.流式細胞術檢測:結果顯示ADSCs陽性表達CD29、CD44、CD90，而CD31、CD45、CD146幾乎不表達，證明分離培養(yǎng)獲得的細胞為較純化的間充質干細胞。
　　3.ADSCs對移植顆粒脂肪重量的影響:移植4周后實驗組A-D組移植物平均重量分別為(354.22±8.44)mg、(413.79±7.30)mg、(465.53±5.18)mg，(470.42±3.87)mg，重量維持率分別為70.84％、82.7

8、6％、93.12％、94.08％。對照組平均重量為(272.37±9.73)mg，重量維持率為54.47％。統(tǒng)計結果顯示，除C、D兩組重量之間無統(tǒng)計學差異外，其他任意兩組均有統(tǒng)計學差異。
　　4.檢測移植脂肪的微血管數量:在實驗組及對照組的中央區(qū)和周邊區(qū)取各5個視野，之后對每個視野中的微血管數量進行計數。利用血管內皮細胞的特異性表面抗原CD34，對切片做免疫組織化學處理，計算出每組每平方毫米面積中的微血管的數量，用均數±標準差的形

9、式來表示。中央區(qū)的血管數量在A-D組實驗組分別為53.43±8.64個，65.74±7.07個，76.79±5.36個，80.34±4.83個，對照組為38.04±9.10個。周圍區(qū)的血管數量在A-D組實驗組分別為65.20±8.14個，77.55±7.37個，88.30±6.33個，91.89±5.61個，對照組為47.42±9.96個。利用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。無論是中央區(qū)還是周邊區(qū)，實驗組與對照組之間均有統(tǒng)計學差

10、異(P＜0.05)，說明實驗組的中央區(qū)和周邊區(qū)的血管數量大于相應的對照組的血管數量;4組實驗組進行比較，無論是中央區(qū)還是周邊區(qū)，除了C組與D組無統(tǒng)計學差異外，其他兩兩比較均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，說明移植干細胞與顆粒脂肪之間存在一個最佳比例，即在此基礎上再增加干細胞的數量也不會增強移植脂肪的血供;各個實驗組及對照組進行組內比較，均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，說明同一組中，中央區(qū)血管數量少于周邊區(qū)的血管數量5免疫組織化學染色在4組

11、實驗組中均檢測到BrdU抗體陽性，說明移植的ADSCs已成活。而對照組BrdU抗體檢測則呈陰性。
　　結論:
　　1.體外提取的脂肪干細胞(ADSCs)與顆粒脂肪混合，移植與裸鼠背部筋膜下后，其中一部分ADSCs轉化為了脂肪細胞，構成受區(qū)有生命力的正常脂肪組織。
　　2.移植的脂肪干細胞可能通過旁分泌的方式促進血管形成，加快移植脂肪組織的新生血管網的重建，從而保證移植脂肪組織有充足的血供，進而降低移植脂肪組織的壞死及吸