奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌β-溶血素基因的克隆、表達與溶血活性分析.pdf

1、根據(jù)GenBank上發(fā)表的金黃色葡萄球菌RF122β-溶血素(h/b)基因序列，用OLIGO6.0設(shè)計一對PCR引物，對金黃色葡萄球菌山東分離株zfb的hlb基因進行PCR擴增、序列測定及生物信息學(xué)分析。測序結(jié)果表明，擴增片斷含有993bp的ORF，可編碼含330個氨基酸的成熟蛋白，與已報道的金黃色葡萄球菌RF122β-溶血素蛋白的氨基酸組成同源性為99.4％。軟件分析顯示我們克隆的金黃色葡萄球菌山東分離株zfb的β-溶血素氨基酸序列中

2、含有核酸內(nèi)切酶/核酸外切酶/磷酸酶(Endonuclease/Exonuclease/phosphatasefamily)和金屬依賴性水解酶ELSH(Metal-dependenthydrolase)兩個保守結(jié)構(gòu)域，說明我們克隆的金黃色葡萄球菌β-溶血素是一種依賴于金屬離子的磷脂酶；進化樹分析可見牛源金黃色葡萄球菌山東分離株zfb的β-溶血素與其它β-溶血素/磷脂酶既有高度的同源性，又存在一定的差異。 通過對pMD18-T/hl

3、b及pET32a+進行BamHⅠ、HindⅢ雙酶切、連接，將hlb基因定向插入pET32a+，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定表明，成功構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET32a/hlb，并轉(zhuǎn)化入表達宿主菌BL21(DE3)，用IPTG進行誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物以融合表達的包涵體形式存在，SDS-PAGE分析重組蛋白表達水平，IPTG誘導(dǎo)后表達的融合蛋白分子量為57KD，表達量占菌體總蛋白的23.9％。 表達產(chǎn)物利用重組表達蛋白所帶的6×His

4、標簽用鎳柱親和層析方法對其進行純化，并用96孔血凝板測定重組蛋白的溶血效價，結(jié)果顯示金葡菌β-溶血素對綿羊紅細胞的溶血效價為278HU/mg，對奶牛紅細胞的溶血效價為9×103HU/mg；以血瓊脂平板法檢測重組蛋白與無乳鏈球菌的CAMP反應(yīng)，結(jié)果顯示重組蛋白在血瓊脂平板上和無乳鏈球菌能發(fā)生明顯的CAMP反應(yīng)。 上述結(jié)果表明，我們成功克隆并表達了牛乳中金黃色葡萄球菌β-溶血素，純化后的重組蛋白保存了很好的溶血活性，而且該毒素對奶牛