AGEs-RAGE軸調控wnt-β-catenin促進人主動脈平滑肌細胞鈣化.pdf

1、目的:探討RAGE是否具有促進動脈平滑肌細胞鈣化的功能，明確RAGE與wnt/β-catenin信號通路的關系，探討RAGE與人動脈平滑肌細胞向成骨性細胞轉化的潛在關系。
　　方法:(1)通過慢病毒顆粒載體介導的RAGE ORF感染細胞，以建立穩(wěn)定高表達RAGE蛋白的細胞模型。綠熒光蛋白表達、流式細胞技術及免疫印跡法檢測驗證細胞穩(wěn)定高表達RAGE蛋白。(2)將正常條件下培養(yǎng)的人主動脈平滑肌細胞作為空白對照組，分為空白對照組、未轉染

2、慢病毒組，空載體慢病毒轉染組、攜帶RAGE慢病毒轉染組，對未轉染慢病毒組，空載體慢病毒轉染組、攜帶RAGE慢病毒轉染組分別以10mmol/Lβ-甘油磷酸、丙酮酸和20mmg/L AGE共同作用下對各組人主動脈平滑肌細胞進行干預培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞生長情況及鈣化情況，第10天時對各組細胞進行馮庫薩染色和鈣定量檢測。(3)將正常條件下培養(yǎng)的人主動脈平滑肌細胞作為空白對照組，分為空白對照組、空載體慢病毒轉染組、RAGE高表達細胞

3、組，分別以10mmol/Lβ-甘油磷酸、丙酮酸和20mmg/L AGE共同作用下對各組人主動脈平滑肌細胞進行干預培養(yǎng)，利用western blotting檢測干預前和干預后各組細胞與成骨相關蛋白的表達情況。(4)利用小分子干擾RNA對細胞β-catenin的表達進行干擾，從而獲得β-catenin低表達細胞模型。仍然以正常條件下培養(yǎng)的人主動脈平滑肌細胞為空白對照組，將實驗分為空白對照組、RAGE高表達細胞干預培養(yǎng)組、對照siRNA組以及

4、β-catenin siRNA抑制組，對經β-catenin si RNA處理過的細胞組進行干預培養(yǎng)。利用蛋白印跡技術對各組細胞OPG、cabfa1的表達進行檢測。
　　結果:(1)綠熒光蛋白表達、流式細胞技術及免疫印跡法檢測結果證實RAGE高表達人主動脈平滑肌細胞模型成功建立。(2)與空白對照組、未轉染慢病毒組，空載體慢病毒轉染組相比，在鈣化+AGEs干預培養(yǎng)下，攜帶RAGE慢病毒轉染組的鈣化程度增強。(3)空白對照組、空載體慢

5、病毒轉染組、RAGE高表達細胞組三組細胞在進行干預培養(yǎng)后，RAGE、β-catenin、OPG、cabfa1蛋白表達較未干預均增強，其中RAGE高表達組細胞中上述因子的表達遠強于其他各組。(4)與RAGE高表達細胞組和對照siRNA細胞組相比，β-catenin siRNA抑制組細胞經β-cateninsiRNA處理后再進行干預培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其下游基因cabfa1和OPG的表達明顯受到了抑制。
　　結論:1.RAGE高表達促進VSMC