丙酸-維生素B12耦合發(fā)酵工藝集成及代謝產(chǎn)物組分控制.pdf

1、丙酸桿菌屬菌株發(fā)酵過(guò)程中不僅會(huì)產(chǎn)生以丙酸為主的有機(jī)酸，還會(huì)產(chǎn)生維生素B12，但是傳統(tǒng)的發(fā)酵過(guò)程往往只收獲一種產(chǎn)品。為了提高發(fā)酵的過(guò)程經(jīng)濟(jì)性，本論文建立了一種以膜分離和離子交換樹(shù)脂原位吸附為特征的新型生物反應(yīng)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了丙酸/維生素B12的雙產(chǎn)物耦合發(fā)酵；通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基中的碳源組分來(lái)調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物中的雜酸組分，提高了底物對(duì)丙酸的轉(zhuǎn)化效率。
　　本論文的主要研究成果如下：
　　一．為解決費(fèi)氏丙酸桿菌批次發(fā)酵過(guò)程中前體物質(zhì)5,6-二

2、甲基苯并咪唑(DMB)對(duì)發(fā)酵的不利影響及丙酸的反饋抑制作用，建立了“邊發(fā)酵、邊分離、邊轉(zhuǎn)化”的半連續(xù)耦合發(fā)酵工藝，實(shí)現(xiàn)了丙酸/維生素B12的聯(lián)產(chǎn)。
　?。?）在膜在線分離菌體的基礎(chǔ)上，引入陰離子層析技術(shù)原位吸附分離發(fā)酵液中的丙酸，解除了丙酸的反饋抑制作用。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)一次弱堿性陰離子交換樹(shù)脂ZGD630吸附分離后，丙酸的產(chǎn)量可達(dá)到57.55 g/L，丙酸產(chǎn)率為0.34 g/(L.h)，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.61 g/g，較批次發(fā)酵分別

3、提高了24.54％、21.43%、19.61%。
　?。?）綜合考慮發(fā)酵罐容積、ZGD630樹(shù)脂吸附載量、膜通量等因素，構(gòu)建了一套10L規(guī)模的丙酸/維生素B12雙產(chǎn)物耦合發(fā)酵系統(tǒng)，建立了維生素B12的細(xì)胞離位轉(zhuǎn)化工藝。結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至84h時(shí)，在膜在線分離菌體的基礎(chǔ)上，向移除丙酸的發(fā)酵清液中接入新鮮的種子液繼續(xù)發(fā)酵84h，加入0.9 mg/L的DMB進(jìn)行維生素B12的后續(xù)轉(zhuǎn)化，發(fā)酵結(jié)束時(shí)維生素B12產(chǎn)量為28.36 mg/L

4、，較批次發(fā)酵提高了18.26%；丙酸產(chǎn)量為59.75 g/L，提高了33.73%。
　?。?）利用雙產(chǎn)物耦合發(fā)酵系統(tǒng)連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)5個(gè)循環(huán)后，丙酸產(chǎn)量累計(jì)達(dá)到122.47g/L，維生素B12的產(chǎn)量累計(jì)為54.81 mg/L，該過(guò)程僅需504h，相當(dāng)于3個(gè)批次發(fā)酵時(shí)間，設(shè)備的利用效率得到了顯著提高，體現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。
　　二．為了有效控制發(fā)酵液中雜酸（丁二酸、乳酸等）的比例，提高碳源對(duì)丙酸的轉(zhuǎn)化效率，以產(chǎn)酸丙酸桿菌為實(shí)驗(yàn)菌株，優(yōu)

5、化了培養(yǎng)基中的碳源組分及濃度、pH調(diào)節(jié)方式，提高了丙酸的產(chǎn)量。
　　（1）比較分析了以葡萄糖、甘油為單一碳源及二者混合使用（不同比例）時(shí)，發(fā)酵液中丙酸、丁二酸、乳酸、乙酸的含量及比例。結(jié)果表明，以葡萄糖和甘油為單一碳源時(shí)，丙酸產(chǎn)量分別為45.58 g/L和48.52 g/L，而丁二酸的產(chǎn)量分別為26.08 g/L和10.29 g/L，而以甘油進(jìn)行流加補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)，乳酸產(chǎn)量先升高后下降，說(shuō)明碳源濃度不同影響雜酸的產(chǎn)生。因此，可通過(guò)調(diào)節(jié)

6、甘油和葡萄糖的比例來(lái)控制發(fā)酵液中的雜酸比例。
　?。?）優(yōu)化了培養(yǎng)基中甘油和葡萄糖的比例，提高了丙酸的產(chǎn)量。結(jié)果表明，當(dāng)甘油和葡萄糖濃度分別為20g/L和80g/L（1:4）時(shí)，丙酸產(chǎn)量為54.75 g/L，提高了20.12%；丁二酸產(chǎn)量為8.49 g/L，降低了67.45%，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.57 g/g，提高了18.75%。
　?。?）采用分段補(bǔ)加的方式，使發(fā)酵液中的甘油濃度維持在5 g/L以下，結(jié)果表明，該發(fā)酵條件下，丙