大腸桿菌O157：H7酶免疫傳感器的研究.pdf

1、腸出血性大腸埃希菌(enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)是近年來(lái)危害最嚴(yán)重的致病腸道菌之一，0157:H7是EHEC最主要的血清型，可引起出血性結(jié)腸炎(Hemorrhagic colonitis HC)、溶血性尿毒綜合征(uremic syndrome hemolytic HUS)和血栓性血小板減少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura TTP)。HC是

2、最常見(jiàn)的臨床癥狀，HUS和TTP的病死率比較高，有時(shí)可高達(dá)30％以上。由于E.coliO157:H7感染劑量極低，且病情發(fā)展快，死亡率高，近年來(lái)歐美、日本等國(guó)都有多次爆發(fā)流行及散發(fā)病例報(bào)道，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，因此建立特異、靈敏及快速的E.coli O157:H7檢測(cè)方法顯得尤為重要。目前E.coli O157:H7的主要檢測(cè)方法有：生化法、免疫法、分子生物法三大類。我國(guó)目前對(duì)E.coli O157:H7檢測(cè)大多數(shù)是采用生化法，從細(xì)

3、菌分離、培養(yǎng)、鑒定需要l周左右的時(shí)間，耗時(shí)耗材，而且檢出率較很低，顯然對(duì)E.coli O157:H7等病原體的暴發(fā)診斷不適宜。其它方法如：膠體金試紙法靈敏度低且不能定量，而DNA探針技術(shù)、PCR技術(shù)等方法存在操作復(fù)雜、儀器設(shè)備及人員要求高的不足。酶免疫傳感器是近年發(fā)展起來(lái)快速檢測(cè)致病微生物的一項(xiàng)新技術(shù)，它將酶電極的電化學(xué)放大作用與免疫電極的特異性相結(jié)合，不但具有免疫反應(yīng)的特異性和電化學(xué)分析的靈敏性,而且具有檢測(cè)設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單，使用方便，構(gòu)

4、建酶免疫電極方法靈活，體系容易集成化，微型化等優(yōu)點(diǎn)。它在食品致病菌分析方面已取得良好效果。在酶免疫傳感器的構(gòu)建中，其關(guān)鍵技術(shù)是酶的固定，使固定化狀態(tài)的酶呈現(xiàn)最大的生物活性，具有較高的穩(wěn)定性可在較寬的pH范圍或不同pH的下操作，并且盡量避免或減少酶的泄漏。 本研究采用了三種不同的酶固定方法：吸附法、分子自組裝膜技術(shù)、電沉積法建立快速檢測(cè)E.coli O157:H7的新型酶免疫傳感器，并對(duì)其性能特點(diǎn)分別進(jìn)行研究探討。 第一部

5、分: 目的：將免疫法特異性和電化學(xué)法靈敏性相結(jié)合，建立一種快速檢測(cè)E.coli O157:H7的新型酶免疫傳感器。 方法：采用吸附法及抗原抗體特異性反應(yīng)將E.coli O157:H7單克隆鼠抗固定在辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG修飾的玻碳電極表面，制備用于檢測(cè)E.coli O157:H7的酶免疫傳感器。通過(guò)循環(huán)伏安法和恒電位法測(cè)定E.coli O157:H7被固定在電極表面引起的電信號(hào)改變進(jìn)行定量分析。 結(jié)果：

6、該酶免疫傳感器的檢出限為5×102cfu／mL，檢測(cè)線性范圍為103～105cfu/mL,相關(guān)系數(shù)為R＝0.970，表觀米氏常數(shù)K appm 值為12.08mmol/L，傳感器響應(yīng)電信號(hào)2周后為初值的80％。 結(jié)論：該傳感器制備方法簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，可進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。 第二部分: 目的：建立基于納米金/L-半胱胺酸修飾的E.coli O157:H7酶免疫傳感器。 方法：采用分子自組裝膜技術(shù)和

7、抗原抗體特異性反應(yīng)將E.coli O157:H7單克隆鼠抗固定在辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG/納米金/L-半胱胺酸修飾的金電極表面，制備用于檢測(cè)E.coli O157:H7的酶免疫傳感器。通過(guò)循環(huán)伏安法和恒電位法測(cè)定E.coli O157:H7被固定在電極表面引起的電信號(hào)改變進(jìn)行定量分析。 結(jié)果：該酶免疫傳感器的檢出限為2×102cfu/mL，檢測(cè)線性范圍為103～105cfu/mL,相關(guān)系數(shù)為R＝0.990，表觀米氏常數(shù)K

8、 appm 值為9.69mmol/L，傳感器響應(yīng)電信號(hào)2周后保持不變。 結(jié)論：與前面的吸附法相比較L-半胱胺酸和納米金的引入增強(qiáng)了電子在酶和電極之間的傳導(dǎo)能力，提高了酶和抗體的固定量及生物活性，使酶免疫電極的靈敏度和穩(wěn)定性增大。 第三部分: 目的：建立基于納米金修飾的E.coli O157:H7酶免疫傳感器。 方法：通過(guò)電沉積法及靜電吸附作用和抗原抗體特異性反應(yīng)將E.coli O157:H7單克隆鼠抗固定

9、在辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG/納米金修飾的玻碳電極表面，制備用于檢測(cè)E.coliO157:H7的酶免疫傳感器。通過(guò)循環(huán)伏安法和恒電位法測(cè)定E.coli O157:H7被固定在電極表面引起的電信號(hào)改變進(jìn)行定量分析。 結(jié)果：在含0.1mol/LPBS(pH7.4),1mmol/L二甲氨基甲基二茂鐵，0.2mmol/L H2O2，30℃的底液中該酶免疫傳感器的檢出限為102cfu/mL，檢測(cè)線性范圍為103～105cfu/mL,

10、相關(guān)系數(shù)為R＝0.996，表觀米氏常數(shù)K appm值為9.02mmol/L，傳感器響應(yīng)電信號(hào)2周后為初值的85％。 結(jié)論：該傳感器制備方法與前兩種相比更簡(jiǎn)單，酶的固定量更多，靈敏度更高。 綜上所述，酶的固定方法對(duì)制備E.Coli O157:H7酶免疫生物傳感器非常重要，在吸附法中未修飾金納米的酶免疫傳感器檢測(cè)的電信號(hào)較弱、穩(wěn)定性與靈敏度較低，而在分子自組裝方法和電沉積方法中，納米金顆粒的表面效應(yīng)使羊抗鼠IgG-HRP被大