無毛大白豬生物學(xué)特征與無毛性狀遺傳機(jī)制研究.pdf

1、為充分了解新發(fā)現(xiàn)“無毛”表型大白豬群體，本研究以無毛表型豬為研究對象，以正常表型大白豬為對照，對“無毛”表型大白豬的生物學(xué)特性，包括生長性能、體尺指標(biāo)、繁殖性能、屠宰性能和肉品質(zhì)進(jìn)行了測定，探討了無毛性狀的遺傳規(guī)律，分析了皮膚組織學(xué)特性，同時采取候選基因關(guān)聯(lián)研究策略，運(yùn)用生物信息學(xué)方法，結(jié)合生物學(xué)軟件分析候選基因的序列特征，采用PCR產(chǎn)物直接測序的方法，篩查與大白豬毛囊發(fā)育和毛囊密度密切相關(guān)的候選基因，為闡明大白豬無毛性狀形成的分子機(jī)制

2、奠定基礎(chǔ)。
　　無毛表型大白豬生物學(xué)特性研究結(jié)果顯示，在相同飼養(yǎng)條件下，無毛表型仔豬初生重、達(dá)100 kg體重日齡、體尺指標(biāo)、100 kg活體背膘厚及繁殖性能均與正常表型大白豬無顯著差異（P＞0.05）。在屠宰性能上，“無毛”表型大白豬宰前活重、胴體重、屠宰率、背膘厚、瘦肉率、脂肪率、骨率、皮率均與正常表型大白豬無顯著差異（P＞0.05）;在肉質(zhì)性狀上，“無毛”表型大白豬肉色、pH值、大理石紋、肌內(nèi)脂肪含量均與正常表型豬無顯著差異

3、（P＞0.05）。結(jié)果表明，“無毛”大白豬在主要生產(chǎn)性能方面均表現(xiàn)正常，無毛性狀對豬的繁殖性能、生長發(fā)育和產(chǎn)肉性能均無顯著影響。
　　通過設(shè)置相同表型間交配及不同表型間正反交雜交組合試驗(yàn)，統(tǒng)計各雜交組合后代的表型，根據(jù)遺傳學(xué)定理，分別對無毛性狀是由一對基因或兩對基因控制的情況進(jìn)行邏輯推理，進(jìn)而確定無毛性狀的遺傳規(guī)律。結(jié)果顯示，大白豬的無毛性狀不是由簡單的一對或兩對基因位點(diǎn)控制的，該結(jié)果表明無毛性狀可能是由更多基因之間相互作用的結(jié)果

4、。
　　通過顯微觀察無毛表型大白豬被毛纖維結(jié)構(gòu)和皮膚組織結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示:無毛表型大白豬毛干鱗片多呈魚鱗狀;毛干髓質(zhì)所占比例較正常被毛小，而皮質(zhì)所占比例相對較大。在不同階段，無毛表型豬被毛纖維平均細(xì)度較被毛正常表型豬小，且均有極顯著差異(P＜0.01)。不同部位真皮層厚度也較正常被毛表型豬薄，且單位面積毛囊密度較小。
　　本研究發(fā)現(xiàn)大白豬的DKK1基因啟動子區(qū)存在4個變異位點(diǎn)-1833C/T、-1808C/G、-1628AAT

5、A插入/缺失、-1268TT插入/缺失，共生成7種單體型。獨(dú)立卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示:3個變異位點(diǎn)-1833C/T、-1808C/G、-1268ins/del的基因型在無毛表型和正常表型中均存在極顯著差異(P＜0.01），由此可知，DKK1基因啟動子區(qū)變異位點(diǎn)基因型分布與無毛表型相關(guān)聯(lián);利用啟動子在線預(yù)測軟件對DKK1基因啟動子區(qū)變異位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，-1833C＞T和-1268(ins/del)變異均未破壞轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，位點(diǎn)-1808C＞G

6、變異，由HNF-1C轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)變?yōu)镃/EBPalp和GR;而位點(diǎn)-1628(ins/del)的變異使得核心區(qū)將不包含TATA-box序列結(jié)構(gòu)。此外，還發(fā)現(xiàn)大白豬β-catenin基因啟動子區(qū)存在3個變異位點(diǎn)-1288G＞T、-1182TATT插入/缺失、-401TATT插入/缺失，共生成5種單體型，研究發(fā)現(xiàn)這些變異位點(diǎn)的基因型分布與無毛表型相關(guān)聯(lián);利用啟動子在線預(yù)測軟件對β-catenin基因啟動子區(qū)變異位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，位點(diǎn)β-ca

7、tenin-1288可結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子為C/EBPalp，堿基G突變?yōu)門后會增加一個YY1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn);位點(diǎn)β-catenin-1182(ins/del)和β-catenin-401(ins/del)變異后使得該位點(diǎn)附近序列能夠結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子隨即丟失，此外β-catenin-1182位點(diǎn)缺失TATT四個堿基后，核心區(qū)也不存在TATA-box序列結(jié)構(gòu)，因而可推測以上變異位點(diǎn)均可能影響基因的轉(zhuǎn)錄活性。
　　根據(jù)DKK1基因啟動子的序列

8、特征，構(gòu)建5個不同缺失片段的pGL3-DKK1雙熒光素酶表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和Hela細(xì)胞，并進(jìn)行雙報告基因活性檢測。結(jié)果顯示，DKK1基因啟動子對239T細(xì)胞具有偏好性，且5個重組pGL3-Basic載體熒光素酶活性均顯著高于pGL3-Basic空載體，其中p-1679/+292 bp啟動子片段活性最高，且顯著高于其他缺失片段(P＜0.01）;-215-+219 bp維持了基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性，為核心啟動子區(qū)域;-586-953 b

9、p區(qū)域可能存在負(fù)調(diào)控元件，在-953-1679 bp區(qū)域可能存在正調(diào)控元件。進(jìn)而構(gòu)建變異位點(diǎn)堿基缺失質(zhì)粒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光素酶活性活性檢測結(jié)果顯示:PGL3-4(-16284N del和-12682N del)的啟動子活性最弱，其次為PGL3-2(-16284Ndel)、PGL3-3(-12682N del)，且均極顯著低于PGL3-1(P＜0.01)，結(jié)果表明變異位點(diǎn)堿基的缺失對DKK1基因的轉(zhuǎn)錄活性有顯著影響(P＜0.

10、01)。
　　依據(jù)β-catenin基因啟動子的序列特征，構(gòu)建3個不同缺失片段的pGL3-β-catenin雙熒光素酶表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和Hela細(xì)胞，并進(jìn)行雙報告基因活性檢測。結(jié)果均顯示，試驗(yàn)組各組相對熒光素酶活性數(shù)值極低。進(jìn)而采用RT-PCR和熒光定量PCR方法，對β-catenin基因在不同細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行相對定量，結(jié)果顯示:表達(dá)量由高到低依次為293T、LNCap、MCF7、PC3、HepG2細(xì)胞。因而可推測該