原位PCR檢測定位豫醫(yī)無毛小鼠無毛基因.pdf

1、鄭州大學碩士學位論文原位PCR檢測定位豫醫(yī)無毛小鼠無毛基因姓名：軒小燕申請學位級別：碩士專業(yè)：免疫學指導教師：杜獻堂20020101原位PCR檢測定位豫醫(yī)無毛小鼠無毛基因似的突變株無毛基因全序列設計引物。應用原位PCR的方法，檢測定位豫醫(yī)無毛小鼠胸腺、脾組織切片和骨髓細胞、淋巴細胞內(nèi)的無毛基因。確定豫醫(yī)無毛小鼠與其他得到國際公認的無毛小鼠，如：rhinomice，hairlessmice等基因結(jié)構(gòu)方面的同源性。結(jié)果1石蠟組織切片上突變基

2、因的獲得：利用基因文庫中的無毛基因全序列設計一對引物，即引物P，和P，。引物5、端用生物素標記。應用豫醫(yī)無毛小鼠的胸腺、脾做石蠟組織切片，正常昆明小鼠的胸腺、脾的組織所做石蠟組織切片作為對照。應用蛋白酶K改變石蠟切片上組織的通透性，用多聚甲醛固定組織，乙醇水化。熱啟動：在PCR擴增前，部分PCR反應混合液(不加TaqDNA多聚酶)94℃預熱5min，然后再加入TaqDNA多聚酶。每張玻片上加40uLPCR反應液，蓋上蓋玻片，液體石蠟封片

3、。于94℃熱板上變性5min，50℃復性10rain，72℃延伸10min；共進行25個循環(huán)。對照：正常昆明小鼠的石蠟切片；豫醫(yī)無毛小鼠石蠟組織切片不加引物對照和不加TaqDNA聚合酶的對照。反應結(jié)束后三氯甲烷，酶學方法檢測雜交信號，在顯微鏡觀察結(jié)果并記錄。確定有雜交信號吸附在組織上。2染色體標本的獲得：用戊巴比妥鈉麻醉豫醫(yī)無毛小鼠和正常的昆明小鼠實驗群。腹部酒精消毒，置超凈臺中，取心臟血大約lml，用淋巴細胞分離液分離，PBS沖洗數(shù)次