應(yīng)用基因隨機(jī)突變提高雞柔嫩艾美耳球蟲EtMIC2蛋白質(zhì)免疫原性的研究.pdf

1、雞球蟲病是一類由專性細(xì)胞內(nèi)寄生的艾美耳球蟲引起的腸道原蟲疾病。據(jù)估計(jì)每年全世界用于預(yù)防和治療球蟲病成本會(huì)超過30億美元，中國(guó)每年約有30多億人民幣。目前球蟲病的防控主要依靠藥物與疫苗，隨著耐藥蟲株的出現(xiàn)和針對(duì)抗球蟲藥物的立法限制，人們更加重視免疫預(yù)防。市場(chǎng)上的疫苗主要為多種雞艾美耳球蟲活卵囊的混合，具有很好的免疫保護(hù)效果，但是由于活疫苗存在安全問題以及較高的生產(chǎn)成本，研究者們將更多的精力用于以亞單位為基礎(chǔ)的新型分子疫苗的研制。
　

2、　新型分子疫苗研制依靠具有較好抗原性以及免疫原性的抗原，由于球蟲復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)以及生活史，抗原鑒定的難度以及抗原免疫原性篩選的限制阻礙了亞單位疫苗研制的進(jìn)展。研究者們也開展了大量的研究來改善抗原的免疫保護(hù)效果，包括新佐劑的研制，益生菌誘導(dǎo)的非特異性免疫等，但是這些都不能從根本上改善抗原的免疫原性。因此，改善已有疫苗可能是一個(gè)快速和有效的方法。
　　定向進(jìn)化被廣泛用于蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，其中重要的應(yīng)用之一就是改善抗原的免疫原性。關(guān)鍵氨基

3、酸的改變對(duì)于抗原的免疫反應(yīng)和免疫識(shí)別有很大影響，比如可逆抑制宿主的免疫反應(yīng)、影響T細(xì)胞的激活、改善蛋白質(zhì)免疫原性等，使用隨機(jī)突變構(gòu)建基因突變庫是定向進(jìn)化常用的方法之一。
　　EtMIC家族蛋白質(zhì)在球蟲移行、入侵宿主細(xì)胞以及胞內(nèi)生存方面有重要的作用，EtMIC2蛋白質(zhì)能夠在柔嫩艾美耳球蟲的整個(gè)生活周期內(nèi)都表達(dá)，研究表明EtMIC2基因或者蛋白質(zhì)能夠誘導(dǎo)部分免疫保護(hù)反應(yīng)，是很好的疫苗候選抗原。使用隨機(jī)突變技術(shù)針對(duì)EtMIC2進(jìn)行定向進(jìn)

4、化，建立基因突變庫，使用酵母表面展示技術(shù)結(jié)合FACS以及動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)篩選目的變異蛋白質(zhì)，從而改善EtMIC2蛋白質(zhì)的免疫原性，為球蟲疫苗的研制提供基礎(chǔ)。
　　1.EtMIC2基因變異庫的構(gòu)建
　　以未突變的EtMIC2基因?yàn)槟０?，使用epPCR進(jìn)行擴(kuò)增，獲得約33μg的epPCR產(chǎn)物，與T1克隆載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。經(jīng)323個(gè)氨芐抗性的瓊脂平板篩選，獲得107個(gè)E coli單克隆。挑取每個(gè)平板上的20個(gè)單菌落進(jìn)行

5、PCR鑒定，6460個(gè)菌落中有5782個(gè)顯示為陽性，陽性率達(dá)到89.5％。為分析epPCR的突變頻率以及突變?cè)诨蛑械姆植?，隨機(jī)選擇了陽性克隆中的21變異EtMIC2基因進(jìn)行序列鑒定，經(jīng)比對(duì)分析在951bp的變異基因中平均出現(xiàn)了6.86±3.21個(gè)突變位點(diǎn)，編碼的蛋白質(zhì)有4.19±2.68個(gè)氨基酸突變，而且突變位點(diǎn)在EtMIC2基因中隨機(jī)分布，與我們之前的試驗(yàn)設(shè)計(jì)一致，結(jié)果證明EtMIC2基因突變庫構(gòu)建成功。
　　2.EtMIC2

6、蛋白質(zhì)變異庫的構(gòu)建
　　PCR擴(kuò)增基因突變庫中的EtMIC2片段，與pCTCON2質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后連接并轉(zhuǎn)染釀酒酵母EBY100，涂布SD-CAA篩選平板，獲得大約為108個(gè)酵母克隆。經(jīng)誘導(dǎo)表面展示后，以兔源抗EtMIC2蛋白質(zhì)多抗作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗兔IgG單抗作為二抗標(biāo)記展示的變異蛋白質(zhì)，使用免疫熒光檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況。利用100mMDTT還原Aga1p和Aga2p之間的二硫鍵，游離表面展示的變異蛋白，使用兔源抗EtM

7、IC2蛋白質(zhì)多抗進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果顯示EtMIC2變異蛋白質(zhì)庫成功展示于酵母細(xì)胞表面。
　　3.EtMIC2蛋白質(zhì)變異庫的篩選
　　使用流式細(xì)胞分選儀對(duì)酵母表面展示的蛋白質(zhì)突變庫進(jìn)行篩選，基于抗原抗體反應(yīng)親和力的強(qiáng)弱為篩選條件設(shè)三個(gè)篩選門（P1，P2和P3），經(jīng)過三次連續(xù)的篩選從108個(gè)進(jìn)樣酵母菌中收集到401個(gè)具有不同熒光信號(hào)強(qiáng)度的細(xì)胞。將篩選的酵母菌涂布固體篩選SD-CAA平板，培養(yǎng)后獲得19個(gè)酵母克

8、隆菌落。為獲得變異EtMIC2的基因序列，提取酵母菌中的重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴(kuò)增與T1載體連接后測(cè)序。經(jīng)分析19個(gè)突變株中有5株蛋白質(zhì)的氨基酸序列未發(fā)生突變，6株蛋白質(zhì)出現(xiàn)終止密碼子，剩余7株變異EtMIC2蛋白質(zhì)分別有2，3，4，6，8，11和14個(gè)突變氨基酸。同時(shí)使用免疫熒光以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)19株變異蛋白質(zhì)的熒光信號(hào)，并分析了與氨基酸突變的關(guān)系。
　　4.變異EtMIC2蛋白質(zhì)抗球蟲感染的保護(hù)效果評(píng)價(jià)
　　將EtMIC2

9、以及7種變異基因克隆至pET30a表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)以及純化后獲得高純度的蛋白質(zhì)，并使用鼠源抗His標(biāo)簽單抗進(jìn)行Western blot進(jìn)行鑒定。將變異蛋白質(zhì)與弗氏佐劑乳化后制作亞單位疫苗，在雛雞7和14日齡時(shí)進(jìn)行頸部皮下多點(diǎn)注射免疫兩次，二免后七天除不免疫不感染球蟲組(PBS-Ⅰ)外皆接種30，000個(gè)柔嫩艾美耳球蟲卵囊。結(jié)果顯示相對(duì)于不免疫感染球蟲組(PBS-Ⅱ)，各蛋白免疫組的體重增長(zhǎng)升高顯著，卵囊排出以及病變積分

10、均有顯著性的降低(P＜0.05)。與未突變的蛋白質(zhì)免疫組相比，1130，2119以及2118組中盲腸病變記分以及1130組糞便的卵囊排出均顯著降低，ACI結(jié)果顯示1130和2119組變異蛋白質(zhì)能夠提供良好的保護(hù)力，而且2119以及1130免疫組的淋巴細(xì)胞針對(duì)EtMIC2和EtMIC2變異蛋白質(zhì)的刺激后的增殖效果，感染球蟲后第10天外周血淋巴細(xì)胞中CD4+和CD8+的比例，以及感染球蟲第0，10天盲腸黏膜中的sIgA的抗體水平都顯著增高(