柔嫩艾美耳球蟲AMA1作用蛋白的篩選及EtMIC2和Et0440基因功能的初步研究.pdf

1、球蟲病是集約化家禽養(yǎng)殖業(yè)最為高發(fā)、風險嚴重且防治工作艱巨的疾病之一，全世界每年因球蟲病造成的虧損和防治費用高達20億英鎊。當前，控制球蟲病的主要方式是使用抗球蟲藥物和活疫苗，但球蟲耐藥性的產生、藥物殘留和活疫苗潛在散毒等問題的產生，推動我們迫切地尋求新的防治途徑來控制球蟲病。子孢子是球蟲從體外侵入宿主細胞發(fā)生感染的第一個階段。阻斷子孢子侵入宿主細胞，是防治球蟲病的一種行之有效的方式。頂膜抗原1(AMA1)是頂復器門原蟲中一種高度保守的微

2、線蛋白，在瘧原蟲、弓形蟲等裂殖子/速殖子入侵宿主過程中，AMA1能與多個棒狀體頸部蛋白(RON2/4/5/8)相互作用，形成復合物，在蟲體侵入宿主細胞過程中發(fā)揮重要的功能。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)柔嫩艾美耳球蟲AMA1(Eimeria tenella AMA1，EtAMA1)在子孢子中蛋白表達水平要明顯高于未孢子化卵囊、孢子化卵囊和裂殖子階段，其抗體能明顯抑制子孢子入侵，表明EtAMA1是子孢子入侵宿主的關鍵蛋白，但機制尚不清楚。本研究旨

3、在利用GST pull-down聯(lián)合質譜技術，篩選出與EtAMA1發(fā)生相互作用的子孢子蛋白，并對其中的兩個潛在作用蛋白的特性進行了研究，研究結果為闡明球蟲子孢子入侵宿主細胞的分子機制奠定基礎。
　　1.柔嫩艾美耳球蟲頂膜抗原-1潛在子孢子互作蛋白的篩選
　　為了篩選與柔嫩艾美耳球蟲頂膜抗原-1(EtAMA1)存在互作的子孢子蛋白，對已構建好的原核表達質pGEX-6P-1-EtAMA1進行重組蛋白的表達與純化，純化的重組蛋白E

4、tAMA1-GST經Western blot驗證，結果顯示在約72 kDa處有單一的目的條帶，證實了所獲得的蛋白為EtAMA1-GST融合蛋白。將EtAMA1-GST蛋白、GST蛋白和PBS分別與谷胱甘肽瓊脂糖珠孵育后，再分別與子孢子裂解物共孵育，洗脫液經SDS-PAGE分析后，結果顯示三者之間的條帶明顯不同，將差異條帶切下進行質譜分析，對獲得的蛋白質肽段與Uniprot中雞球蟲蛋白質數(shù)據(jù)庫進行blast比對，初步獲得了10個與EtAM

5、A1存在潛在互作的柔嫩艾美耳球蟲子孢子蛋白，包括微線體蛋白、糖酵解酶類、肌動蛋白相關因子以及一些保守蛋白等，廣泛參與了蟲體的入侵、發(fā)育、能量代謝等生物學過程。研究結果為進一步闡明EtAMA1在球蟲入侵宿主細胞中發(fā)揮重要作用的分子機制奠定基礎。
　　2.柔嫩艾美耳球蟲0440和MIC2蛋白與AMA1蛋白互作關系的驗證
　　從獲得的10個與EtAMA1潛在互作的子孢子蛋白中，選取柔嫩艾美耳球蟲微線體蛋白2(Microneme p

6、rotein2，EtMIC2)和假想蛋白0440(Et0440)進行進一步試驗。以柔嫩艾美耳球蟲子孢子cDNA為模板，通過PCR擴增獲得EtMIC2和Et0440基因的開放閱讀框，其中，EtMIC2基因的部分ORF為1029bp，編碼342個氨基酸，編碼蛋白理論分子量為38kDa; Et0440基因的開放閱讀框大小為423bp，編碼140個氨基酸，編碼蛋白理論分子量為15.5kDa。構建pcDNA3.1(+)-flag-Et0440、

7、pcDNA3.1(+)-flag-EtMIC2、pBiFC-VN155-Et0440和pBiFC-VN155-EtMIC2真核表達質粒，并將其轉染至DF-1細胞，經Western Blot和間接免疫熒光鑒定真核質粒均表達后，通過免疫共沉淀(Co-IP)和雙分子熒光互補(BiFC)技術對蛋白是否與EtAMA1存在相互作用進行驗證。 Co-IP結果顯示，兩實驗組均無蛋白復合物的形成，只出現(xiàn)EtAMA1的特異性條帶，說明EN440與EtAMA

8、1、EtMIC2與EtAMA1不存在相互作用。BiFC結果顯示，陽性對照組產生綠色熒光，而陰性對照組， pBiFC-VN155-Et0440和pBiFC-VC155-EtAMA，pBiFC-VN155-EtMIC2和pBiFC-VC155-EtAMA1無綠色熒光，說明Et0440與EtAMA1、EtMIC2與EtAMA1不存在相互作用。
　　3.柔嫩艾美耳球蟲Et0440和EtMIC2基因的原核表達及其功能的初步研究
　　將

9、Et0440和EtMIC2基因片段分別連接到原核表達載體pET32a和pET30a上，轉化至大腸桿菌BL21中，在37℃條件下加入IPTG成功誘導表達重組蛋白His-Et0440和His-EtMIC2。將重組蛋白純化后免疫新西蘭大白兔制備多抗血清，Western blot結果顯示Et0440和EtMIC2均具有良好的免疫原性和反應原性。利用間接免疫熒光技術結果顯示， Et0440主要分布于經細胞培養(yǎng)基孵育后子孢子的前端和第二代裂殖子的頂

10、端，第一代裂殖子的兩端;而EtMIC2主要分布在子孢子和第二代裂殖子的前端，第一代裂殖子的兩端。純化重組蛋白His-Et0440和His-EtMIC2制備的多抗進行體外抑制實驗，結果顯示與兔IgG處理子孢子對照組相比，anti-Et0440在濃度為400μg/mL時，抑制率達到40％以上，可以明顯的抑制蟲體入侵細胞;與兔IgG處理子孢子對照組相比，anti-EtMIC2在濃度為400μg/mL時，抑制率達到20％，存在抑制作用，但是與E

11、t0440相比要低，因此初步推測Et0440和EtMIC2可能與蟲體入侵宿主細胞相關。
　　4.柔嫩艾美耳球蟲Et0440和EtMIC2真核表達質粒免疫保護效能評價
　　7日齡雛雞進行稱重隨機分為八組，使各組的平均初重基本相同。分別肌肉注射100μg/羽和200μg/羽的真核重組表達質粒pcDNA3.1(+)-flag-Et0440、pcDNA3.1(+)-flag-EtMIC2及空質粒pcDNA3.1(+)-flag，同時

12、設置感染對照組和健康對照組，一免七天后進行二免，在二免七日后經口服接種1萬/羽柔嫩艾美耳球蟲上海株孢子化卵囊，通過對體重、盲腸病變記分、卵囊排出量等指標檢測的檢測來評價免疫效果。實驗結果顯示，免疫期間，實驗組、感染對照組和健康對照組增重差異不顯著(P＞0.05)。在攻蟲后9天，免疫組增重普遍高于感染對照組增重，其中pcDNA3.1-flag-0440(200μg/羽)組增重明顯高于感染對照組(P＜0.05)，說明柔嫩艾美耳球蟲對雞的生長

13、發(fā)育具有明顯的抑制作用，而重組質粒對于抵抗球蟲感染具有一定的作用;各實驗組卵囊減少率均在65％以上，明顯高于感染對照組和空載體對照組。同時我們檢測了細胞因子的水平，結果顯示，二免后7天實驗組IFN-γ和攻蟲后實驗組IL-17均明顯高于對照組(P＜0.05)，而免疫后和攻蟲后TGF-β的變化均不顯著(P＞0.05)。以上結果表明，重組質粒pcDNA3.1(+)-flag-Et0440和pcDNA3.1(+)-flag-EtMIC2對感染柔