miR-125b在C3H10T1-2間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中的表達及其靶基因分析.pdf

1、研究背景及目的:
　　微小RNA(microRNA、miRNA、miR)是一類長約21-25nt的單鏈小分子RNA(single-stranded RNA,ssRNA),位于細胞染色體的非編碼區(qū),是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA,即非編碼RNA(non-codingRNA,ncRNA),通過調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝過程而發(fā)揮其生物學(xué)作用。miRNA通過與其靶mRNA分子的3’端非翻譯區(qū)(3’-untranslational region,3'

2、UTR)互補配對,抑制靶mRNA的翻譯或降解靶mRNA,從而負性調(diào)控靶基因表達。近年來,越來越多的證據(jù)表明,miRNA通過下調(diào)維持干細胞未分化狀態(tài)的某些基因,同時激活干細胞譜系特異性基因,調(diào)節(jié)干細胞的定向分化,如成骨分化、成脂分化等。
　　成骨細胞是骨形成中的一類重要細胞,源于間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。在MSCs向成骨細胞分化過程中存在多水平的調(diào)控機制,多種激素及旁分泌和/或自分泌細胞

3、因子被證實參與這一調(diào)節(jié)。有文獻報道提示miR-125b可能是骨髓MSCs向成骨細胞分化過程中的一個重要調(diào)節(jié)因子,但具體調(diào)節(jié)機制還有待進一步探索。因此,本研究旨在探明miR-125b在MSC成骨分化過程中的表達變化,明確其靶基因,初步探討miR-125b調(diào)節(jié)MSCs成骨分化的可能機制。
　　方法:
　　1.以miR-125b為研究對象,利用基因芯片檢測小鼠間充質(zhì)干細胞C3H10T1/2成骨分化過程中miRNA表達譜,以未分化細

4、胞為對照組,誘導(dǎo)成骨分化7天(第一組)、14天(第二組)為實驗組,分析三組之間miRNA尤其是miR-125b表達差異。另外,利用實時定量RT-PCR檢測成骨分化1、3、5天后miR-125b表達結(jié)果。
　　2.為明確miR-125b作用靶點,我們通過picTar、miRanda、Targetscan三個數(shù)據(jù)庫進行生物信息學(xué)分析,查找miR-125b的潛在靶基因,在miR-125b的眾多預(yù)測靶基因中,挑選具有成骨調(diào)節(jié)作用的核心結(jié)合

5、因子Cbfβ進行實驗驗證。
　　3.為了驗證Cbfβ3’-UTR是miR-125b作用的真正靶點,我們將預(yù)測的Cbfβ3’-UTR靶位點上下游片段進行克隆、突變后,插入PmiR-report熒光素酶表達載體中,以pRL-TK為內(nèi)參照載體。為了獲得足夠的最終實驗結(jié)果信息,根據(jù)Cbfβ3’UTR預(yù)測結(jié)合位點序列合成了:①miR-125b完全互補序列(PerfectTarget,PT),②野生型結(jié)合位點序列(microRNA recog

6、nition element,MRE),③去掉種子結(jié)合區(qū)的突變形式結(jié)合序列(MRE-mutation,mut)。為增加效能,分別使用2×PT,2×MRE,2×mut,前期文獻已證實了這種質(zhì)粒構(gòu)建方式的適用性。然后將重組質(zhì)粒、對照質(zhì)粒miR-125bmimic或anti-miR-125b共轉(zhuǎn)染293T細胞,48小時后裂解細胞行雙熒光素酶報告基因檢測。
　　4.在C3H10T1/2細胞中過表達外源性miR-125b和干擾表達內(nèi)源性mi

7、R-125b,48小時后行Western-Blot和RT-PCR檢測Cbfβ表達量變化,觀察miR-125b對Cbfβ的調(diào)控作用。
　　研究結(jié)果:
　　1.生物芯片結(jié)果顯示:①C3H10T1/2細胞誘導(dǎo)分化7天組與未分化組對比:表達量上調(diào)分子12個,下調(diào)分子30個;分化14天組與分化7天組對比,表達上調(diào)miRNA分子92個,下調(diào)miRNA分子94個;分化14天組與未分化組對比:表達量上調(diào)分子84個,下調(diào)分子98個(上調(diào)以2倍

8、為下限,下調(diào)以0.5倍為上限)。②C3H10T1/2細胞誘導(dǎo)分化7天組和14天組miR-125b表達量與未分化組表達量比值分別為:未分化組/分化7天組/分化14天組=1/0.8710/0.6378.。實時定量RT-PCR檢測結(jié)果示:C3H10T1/2細胞成骨誘導(dǎo)分化1、3、5天后miR-125b表達量較未分化組明顯降低(P<0.05)。
　　2.生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,小鼠種系miR-125b作用靶點共計342個,其中包括在骨形成

9、過程中具有重要作用的核心結(jié)合因子Cbfβ,CbfβmRNA的3’-UTR含有一個與miR-125b種子序列匹配的潛在結(jié)合位點。
　　3.重組質(zhì)粒pMIR-2×PT,pMIR-2×MRE,pMIR-2×mut經(jīng)HindⅢ單酶切,瓊脂糖凝膠電泳,可于5000-7500bp之間獲得目的條帶。送大連TAKARA公司測序,結(jié)果示堿基序列和設(shè)計序列完全一致,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果:將PmiR-2×PT與miR-125bm

10、imic或anti-miR-125b共轉(zhuǎn)染293T細胞后,熒光素酶活性有顯著減少或增加,證實了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烍w系的有效性。將PmiR-2×MRE與miR-125bmimic共轉(zhuǎn)染細胞后,熒光素酶表達受到明顯抑制,而轉(zhuǎn)染PmiR-2×mut與miR-125bmimic后,熒光素酶表達無明顯變化。另外,我們發(fā)現(xiàn)將anti-miR-125b與PmiR-2×MRE、miR-125bmimic共轉(zhuǎn)染后,可中和掉miR-125bmimic對

11、PmiR-2×MRE的抑制作用;將anti-miR-125b與PmiR-2×mut、miR-125bmimic共轉(zhuǎn)染后,熒光素酶活性仍無明顯變化。實驗重復(fù)3次,結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　4.Western-Blot和RT-PCR結(jié)果顯示:在C3H10T1/2細胞中過表達miR-125b,Cbfβ蛋白和mRNA表達量明顯降低;用轉(zhuǎn)染anti-miR-125b的方式抑制miR-125b后,Cbfβ蛋白和mRNA表達量明顯