鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC39A6-ZIP6在斑馬魚造血中的作用.pdf

1、【目的】利用基因組編輯技術(shù)轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(TALENs)，建立斑馬魚鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC39A6/ZIP6基因靶向敲除模型。在模型基礎(chǔ)上，比較基因敲除技術(shù)和敲降的異同。同時(shí)，探究SLC39A6/ZIP6基因在斑馬魚造血中的作用，為深入理解該基因?qū)υ煅l(fā)育及調(diào)控提供理論依據(jù)，為血液疾病的診斷和治療提供選擇。
　　【方法】本研究中，針對(duì)鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC39A6/ZIP6基因設(shè)計(jì)并構(gòu)建高效的TALENs人工核酸酶，T7E1內(nèi)

2、切酶和T載體克隆法檢測(cè)切割效率。利用體外轉(zhuǎn)錄和顯微注射單細(xì)胞受精卵等方法，構(gòu)建斑馬魚突變體。提取斑馬魚基因組DNA和RNA，PCR擴(kuò)增、T載體克隆、基因測(cè)序和RT-PCR等方法鑒定突變體。整胚胎原位雜交技術(shù)和RT-PCR等檢測(cè)造血系統(tǒng)各系特異性基因表達(dá)水平。鋅離子熒光探針檢測(cè)體內(nèi)鋅離子分布。
　　【結(jié)果】針對(duì)SLC39A6/ZIP6基因的TALENs顯示出高效的切割活性，約為23.8％。同時(shí)成功獲得一種突變形式的ZIP6基因純合敲

3、除斑馬魚模型。該模型的表型不同于嗎啉寡聚核苷酸(MO)敲降的結(jié)果，而且新發(fā)現(xiàn)敲除模型4dpf時(shí)出現(xiàn)明顯心包水腫，并且體內(nèi)鋅離子分布異常。檢測(cè)造血系統(tǒng)各系發(fā)育情況，c-myb、lck、rag1和rag2基因RNA水平表達(dá)量減少。
　　【結(jié)論】本研究探索SLC39A6/ZIP6基因的功能，發(fā)現(xiàn)基因敲除技術(shù)建立的純合模型是優(yōu)于之前瞬時(shí)不完全的基因敲降模型，其結(jié)果更可信、穩(wěn)定和全面。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC39A6/ZIP6在斑