去甲基STI—571的合成和抗白血病作用研究.pdf

1、惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率近年來(lái)一直不斷升高，嚴(yán)重危害著人類的生命健康。在發(fā)達(dá)國(guó)家和中等發(fā)達(dá)國(guó)家，惡性腫瘤是僅次于心血管疾病的第二生命殺手；而在中國(guó)，惡性腫瘤已經(jīng)成為死亡原因之首，因此尋找有效的治療方法成為當(dāng)務(wù)之急。 自從第二次世界大戰(zhàn)后第一個(gè)抗腫瘤藥問(wèn)世以來(lái)，醫(yī)藥工作者就試圖尋找有效的抗腫瘤的藥物。多年以來(lái)，抗腫瘤的藥物主要是靜脈注射的細(xì)胞毒性藥物，它的作用靶點(diǎn)限于細(xì)胞水平，通過(guò)改變細(xì)胞核DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)，微管蛋白合成，干擾核酸

2、的合成和轉(zhuǎn)錄等抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長(zhǎng)，特異性和專一性不佳。同時(shí)其抗腫瘤作用遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)原則，即殺傷一定比例而不是一定數(shù)量的腫瘤細(xì)胞，其療效呈劑量或時(shí)間依賴性。藥物在作用于腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也對(duì)某些正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，很多患者出現(xiàn)脫發(fā)，消化道癥狀和骨髓抑制等，而且這種毒性作用也呈劑量或時(shí)間依賴性。因此，尋找一種高效低毒的靶向性抗腫瘤藥一直是醫(yī)藥工作者努力的目標(biāo)。 近年來(lái)，隨著人類基因組的闡明，分子和細(xì)胞生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和

3、生物信息學(xué)的進(jìn)步，人們對(duì)腫瘤的發(fā)生，發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有了全新的認(rèn)識(shí)，腫瘤的藥物治療出現(xiàn)了突破性進(jìn)展——分子靶向治療，它是以腫瘤組織或細(xì)胞所具有的特異性結(jié)構(gòu)分子作為靶點(diǎn)，使用某些能與這些靶分子結(jié)合的抗體、配體等達(dá)到直接治療或?qū)蛑委熌[瘤的一類療法。其最大的優(yōu)點(diǎn)是選擇性地抑制或殺死腫瘤細(xì)胞，而不損傷人體的正常細(xì)胞，因而是一類極具發(fā)展前景的癌癥治療藥物。目前已有多種分子靶向藥物用于腫瘤治療，包括肺癌、乳腺癌、大腸癌、胃腸道間質(zhì)瘤，惡性淋巴瘤，白血病

4、，多發(fā)性骨髓瘤等。分子靶向藥物按照分子大小可以分為兩類： 大分子單克隆抗體，如Rituximab、Heceptin、Erbitux和Avastin等；小分子酪氨酸激酶抑制劑，如Glivec、Iressa、Tareeva等。蛋白酪氨酸激酶(Protein tyrosine kinases，PTKs)是一類具有酪氨酸激酶活性的蛋白質(zhì)，可使重要蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)眾多信號(hào)傳導(dǎo)通路，包括Ras／MAPK、STAT

5、、JNK、P13K／AKT等，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和增殖等過(guò)程。蛋白酪氨酸激酶可分為受體型(RTKs)和非受體型(NRTKs)。RTKs是跨膜結(jié)構(gòu)，胞外區(qū)域和對(duì)應(yīng)配體結(jié)合，而胞內(nèi)區(qū)域具有酪氨酸激酶催化活性，RTK家族包括胰島素受體和多種生長(zhǎng)因子受體，如EGF，PDGF,FGF,NGF等。NRTKs雖無(wú)胞外和跨膜結(jié)構(gòu)，但是也具有靶向亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和催化活性的區(qū)域，NRTK家族包括Src，Abl，F(xiàn)AK和JAKs等。蛋白酪氨酸激酶的異常表達(dá)將

6、導(dǎo)致細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移，并與腫瘤的化療抗性密切相關(guān)，因此PTKs就成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。 小分子蛋白酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)是一類能明顯抑制了酪氨酸激酶活性的藥物。與靶向抗體作用于細(xì)胞膜不同，酪氨酸激酶抑制劑進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)揮作用，通過(guò)與ATP位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合選擇性地抑制酪氨酸激酶活性，從而阻止下游蛋白的磷酸化，切斷異常的酪氨酸激酶的信號(hào)傳導(dǎo)，從而

7、阻止細(xì)胞的增殖和腫瘤的形成。因?yàn)橐种苿┨禺愋缘刈饔糜谀[瘤細(xì)胞，故而與傳統(tǒng)化療相比毒性較低。目前已經(jīng)有多個(gè)靶向酪氨酸激酶的ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑被批準(zhǔn)用于治療腫瘤，在我國(guó)已經(jīng)上市的共有四個(gè)，它們是依馬替尼，吉非替尼(gefitinib)，埃羅替尼(erlotinib)和索拉非尼(sorafenib)。因?yàn)榀熜Ш?，毒性低，易于服用而為人們所喜?ài)。但是其昂貴的價(jià)格讓人望而卻步，因此自主研發(fā)一些療效好，同時(shí)價(jià)格又可以是廣大病人承受的靶向性抗腫瘤藥是

8、我國(guó)醫(yī)藥工作者的當(dāng)務(wù)之急。 2001年，分子靶向性藥物甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate，Gleevec，STI571)的上市，標(biāo)志著靶向性腫瘤治療的開(kāi)端。甲磺酸伊馬替尼是苯氨嘧啶的衍生物，又稱CGP57148B，是一種強(qiáng)效酪氨酸激酶抑制劑，其作用靶位主要有3種： BCR／ABL，c-Kit(CD117)，血小板衍生物生長(zhǎng)因子(PDGF)受體。已被批準(zhǔn)用于治1療慢性粒細(xì)胞白血病(CML)加速期、急變期和慢

9、性期干擾素耐藥的患者，及不能手術(shù)或轉(zhuǎn)移的胃腸道間質(zhì)瘤(GISTs)。依馬替尼的藥物代謝動(dòng)力學(xué)表明，在人體內(nèi)95％依馬替尼與血漿蛋白結(jié)合(主要是白蛋白和α1酸糖蛋白)，消除半衰期為18小時(shí)，主要在肝臟和腸道經(jīng)細(xì)胞色素P450同工酶代謝(主要是肝臟中的CYP3A4 and CYP3A5)，通過(guò)其甲基哌嗪環(huán)上的去甲基而產(chǎn)生去甲基的依馬替尼(去甲基ST1571，CGP74588)，該主要代謝物在人體內(nèi)有著較長(zhǎng)的半衰期，約40個(gè)小時(shí)，但對(duì)此代謝物

10、的生物學(xué)作用迄今尚未有研究。仔細(xì)分析依馬替尼的藥物結(jié)構(gòu)和研發(fā)過(guò)程可以得知，該藥物分子的活性部分在其苯氨衍生物上，而甲基哌嗪環(huán)的作用主要是增加藥物的溶解性和生物利用度。因此從理論上來(lái)推論，CGP74588的生物活性應(yīng)該存在的，而且它的毒性應(yīng)該是低的。因此本文報(bào)道了CGP74588的化學(xué)合成，抗白血病活性以及毒性試驗(yàn)。目的：試圖以ST1571作為模型分子來(lái)發(fā)現(xiàn)新的靶向性抗癌分子。 本研究在成功闡述了CGP74588的化學(xué)合成，在此

11、基礎(chǔ)上，首先觀察了CGP74588和ST1571對(duì)BCR／ABL陽(yáng)性的白血病細(xì)胞株K562和BCR／ABL陰性的U937的抑制作用，體外研究結(jié)果表明，CGP74588和STI571都對(duì)K562細(xì)胞有明顯的抑制作用，并呈明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。而且CGP74588對(duì)K562細(xì)胞的作用與依馬替尼十分接近，其IC50略小于0.8μM。CGP74588對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用在24小時(shí)已經(jīng)為最大作用的50％，48小時(shí)后作用已經(jīng)趨于飽和。而CGP7

12、4588對(duì)U937細(xì)胞無(wú)明顯的的抑制作用。 CGP74588對(duì)白血病患者外周血白細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，此抑制作用與濃度成正比；但CGP74588對(duì)正常人外周血的白細(xì)胞只有輕微的非特異的抑制。 以K562細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀察CGP74588促凋亡作用。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，CGP745881μM作用于K562細(xì)胞24小時(shí)后即出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞胞體變小，胞膜皺縮，核固縮及凋亡小體等；DNA瓊脂糖電泳顯示CGP7

13、45881μM作用于K562細(xì)胞48小時(shí)后出現(xiàn)特征性的“梯級(jí)”調(diào)亡條帶；流式細(xì)胞儀DNA倍體分析檢出典型的亞二倍體(sub-G)凋亡峰和G1期抑制，呈明顯的時(shí)間和濃度依賴性。上述結(jié)果充分說(shuō)明，CGP74588具有誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的作用，并與STI571作用相似。細(xì)胞毒性試驗(yàn)觀察了CGP74588對(duì)2種Ph-白血病細(xì)胞株(HL60和NB4)，2種實(shí)體瘤細(xì)胞株(A549和HT29)和正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞的作用，研究結(jié)果顯示CGP745

14、88對(duì)上述細(xì)胞不敏感，僅有非特異的毒性作用，CGP74588在10Um時(shí)開(kāi)始對(duì)它們產(chǎn)生毒性作用，此濃度是K562細(xì)胞IC50的13倍，CGP74588對(duì)細(xì)胞的毒性作用和STI571十分接近。 動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果也驗(yàn)證了細(xì)胞學(xué)毒性的結(jié)果，CGP74588 50mg／kg時(shí)小鼠出現(xiàn)體重下降，呈時(shí)間依賴性，最大為24.4％，而且出現(xiàn)食納下降，腹瀉，疼痛等癥狀。而CGP74588 5mg／kg時(shí)小鼠幾乎無(wú)異常表現(xiàn)，所以小鼠對(duì)CGP74588