慢性髓系白血病STI571耐藥中PTP活性檢測(cè)和Bcr-Abl基因ATP結(jié)合區(qū)的測(cè)序分析.pdf

1、研究背景和目的：慢性髓系白血病(CML)是一種累及造血干細(xì)胞的惡性克隆增殖性疾病。Ph染色體是其腫瘤惡性克隆標(biāo)志，所形成的BCR-ABL融合基因編碼的p210BCR/AB，具有異常增高的蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase，PTK)活性，是導(dǎo)致慢性髓系白血病發(fā)生的根本原因。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化的平衡狀態(tài)有賴于蛋白激酶和蛋白磷酸酶的協(xié)同作用，酪氨酸殘基(Tyr)的磷酸化是一個(gè)可逆的動(dòng)態(tài)過程，主要受蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪

2、氨酸磷酸酶(proteintyrosinephosphatase,PTP)兩大酶家族控制，他們相互拮抗與協(xié)調(diào)，在機(jī)體內(nèi)構(gòu)建了一個(gè)Tyr磷酸化狀態(tài)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。 通過抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶活性，進(jìn)而抑制CML細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡是治療CML新的策略。STI571又名甲磺酸伊馬替尼(Imatinibmesylate)、格列衛(wèi)(Gleevec)，是第一個(gè)被批準(zhǔn)上市的酪氨酸激酶抑制劑，作用靶點(diǎn)為bcr/abl蛋白酪氨酸激酶，

3、它能競(jìng)爭(zhēng)性抑制ATP或底物與酪氨酸激酶催化中心結(jié)合，阻滯酪氨酸激酶活化作用，阻斷其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，直接靶向費(fèi)城染色體(Philadelphiachromosome，Ph)陽(yáng)性細(xì)胞，從而阻止細(xì)胞的增殖和腫瘤的形成。本課題組前期研究結(jié)果：STI571處理K562細(xì)胞后，PTP家族的部分成員表達(dá)上調(diào)，提示有相關(guān)PTP參與了STI571誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的過程。隨著臨床應(yīng)用病例數(shù)的增加，STI571的耐藥問題引起了人們的關(guān)注。尤其是該藥對(duì)CML

4、急變期的病人治療效果不理想，耐藥問題已成為是抗腫瘤治療失敗的主要原因。 目前的研究表明，STI571的耐藥機(jī)制有多種，包括非特異的多藥耐藥基因表達(dá)Bcr-Abl基因本身的遺傳變異和其它蛋白激酶的活化等等。原發(fā)耐藥絕大多數(shù)與Bcr-Abl融合基因無(wú)關(guān)，獲得療效后再次復(fù)發(fā)者，大多數(shù)與Bcr-Abl酪氨酸激酶的再活化相關(guān)，目前認(rèn)為主要原因之一是Bcr/Abl融合基因ATP結(jié)合區(qū)的點(diǎn)突變。 本實(shí)驗(yàn)擬通過耐藥細(xì)胞系K562/G01

5、的基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)、胞漿蛋白PTP活性分析，初步確立了參與STI571的耐藥過程的部分PTP成員；同時(shí)，對(duì)臨床應(yīng)用STI571治療的CML病人進(jìn)行PTP活性檢測(cè)和Abl基因ATP結(jié)合區(qū)序列分析，以確立二者在STI571耐藥診斷中的臨床意義。 研究方法：1.K562/G01細(xì)胞系在本實(shí)驗(yàn)室條件下的耐藥特性的鑒定：用MTT法檢測(cè)STI71對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞毒作用、Hoechst33342熒光染色檢測(cè)調(diào)亡情況。 2.利用cDNA表

6、達(dá)譜芯片技術(shù)初步篩選耐藥細(xì)胞K562/G01與K562/W差異表達(dá)基因，應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證芯片結(jié)果；進(jìn)一步檢測(cè)耐藥細(xì)胞K562/G01、對(duì)STI571耐藥的CML病人單個(gè)核細(xì)胞胞漿蛋白PTP活性，了解PTP與耐藥的相關(guān)性。 3.將CML病人分為對(duì)STl571耐藥和非耐藥兩組，進(jìn)行骨髓單個(gè)核細(xì)胞Abl基因ATP結(jié)合區(qū)序列分析，了解Abl酪氨酸激酶ATP結(jié)合區(qū)點(diǎn)突變情況。PCR產(chǎn)物的序列長(zhǎng)度為344bp，其中的180bp

7、(98bp～277bp)為Abl激酶的第906bp～1085bpDNA序列片段，涵蓋了Abl激酶的ATP結(jié)合區(qū)序列。 研究結(jié)果：1.MTT法檢測(cè)細(xì)胞STI571耐藥性：K562-W和K562/G01的IC50(半數(shù)抑制濃度)分別為(0.48±2.04)uM和(5.67±1.52)uM，K562/G01的耐藥倍數(shù)為(11.8+1.35)倍。Hoechst33342熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分率：STI571濃度4.0uM培養(yǎng)24h后活

8、細(xì)胞百分?jǐn)?shù)仍達(dá)98.5％，說(shuō)明K562/G01對(duì)抗STI571的調(diào)亡作用明顯增強(qiáng)。。 2.耐藥細(xì)胞K562/G01基因表達(dá)譜芯片分析發(fā)現(xiàn)：總共有566個(gè)基因出現(xiàn)差異表達(dá)，297個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，269個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，其中1個(gè)PTP成員出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)[PTPRF(PPFIA4)基因，Ratio0.413，GenbankID：NM_015053]，1個(gè)PTK成員表達(dá)升高(PTK9基因Ratio=2.004，GenebankID：NM19

9、8974)。半定量RT-PCR驗(yàn)證符合芯片結(jié)果。 3.胞漿蛋白PTP活性檢測(cè)：K562/G01細(xì)胞胞漿蛋白PTP活性(126.45pmol/min/ug)較K562/W活性(137.32pmol/min/ug)降低；耐藥組病人骨髓單個(gè)核細(xì)胞胞漿蛋白PTP活性(均數(shù)為124.83±12.14pmol/min/ug)較非耐藥組病人(均數(shù)138.75±13.29pmol/min/ug)也降低，P=0.04。 4.K562/G0

10、1耐藥細(xì)胞Abl激酶ATP結(jié)合區(qū)DNA測(cè)序：堿基序列與K562/W相同，與Abl激酶原序列相比，有兩個(gè)同義點(diǎn)突變，第1062堿基A被G替換，第1085堿基A被G替換；均位于密碼子第3個(gè)堿基，為同義密碼子，未導(dǎo)致氨基酸的改變。 CML病人骨髓細(xì)胞Abl激酶ATP結(jié)合區(qū)測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在8例耐藥急變的病人中2例病人第944位核苷酸C→T單個(gè)堿基出現(xiàn)點(diǎn)突變，使蘇氨酸(Thr)突變?yōu)楫惲涟彼?Ile)。1例CML-CP的病人第1070堿基

11、A→G替換，導(dǎo)致357位賴氨酸(Lys)→精氨酸(Arg)。 主要結(jié)論：1.K562/G01耐藥細(xì)胞cDNA表達(dá)譜芯片分析發(fā)現(xiàn)PTP家族有1個(gè)成員PTPRF(PPFIA4)表達(dá)下調(diào)，耐藥細(xì)胞和臨床耐藥組病人胞漿蛋白PTP活性均降低。說(shuō)明PTP家族部分成員可能參與了STI571的耐藥機(jī)制，PTP活性降低可以提示病人臨床出現(xiàn)STI571耐藥傾向。 2.在8例STI571耐藥急變的CML患者中，2例檢測(cè)出Bcr-Abl激酶AT