β-淀粉樣肽40對(duì)ECV-304細(xì)胞損傷及RAGE和NF-κB表達(dá)的影響.pdf

1、目的：觀察不同濃度、不同時(shí)間β-淀粉樣肽40(amyloid-β40，Aβ40)誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷過(guò)程中糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advancedglyeation end-products，RAGE)和核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的表達(dá)情況，探討Aβ40對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的程度及其機(jī)制。 方法： 1．培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(human umbilical endotheli

2、um cells，ECV-304)，建立Aβ40誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。 2．A1340誘導(dǎo)ECV-304細(xì)胞損傷30min、3h、3d后，倒置顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)變化；四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測(cè)3d時(shí)Aβ40(0.005μM、0.05μM、0.5μM、5μM、50μM)作用細(xì)胞的增殖情況，并從中篩選出最適損傷濃度。 3．留取30min、3h以及3d細(xì)胞培養(yǎng)上清液

3、，比色法測(cè)定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(maleicdialdehyde，MDA)以及硝酸還原酶法測(cè)定一氧化氮(nitric oxide，NO)的含量。 4．采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)Aβ40介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷過(guò)程中RAGE mRNA水平的表達(dá)情況

4、。 5．免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)Aβ40誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷過(guò)程中NF-κB的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1．細(xì)胞形態(tài)學(xué)：30min及3h無(wú)明顯變化，3d時(shí)50μM Aβ40與細(xì)胞孵育后，細(xì)胞胞體腫脹，胞漿空泡化，細(xì)胞排列紊亂數(shù)量減少，其他濃度無(wú)明顯變化，仍可見(jiàn)ECV-304細(xì)胞呈單層鋪路石狀緊密排列。 2.3d時(shí)細(xì)胞生存率(％)，篩選Aβ40損傷內(nèi)皮的適宜濃度：0.5μM組(81.99±9.01)和0.5μM

5、組(80.86±9.60)與0.005μM組(91.19±4.66)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；5μM組(73.33±1.56)與0.005μM組比較細(xì)胞生存率明顯下降(P<0.01)；50μM組(25.39±3.11)與其他各組比較細(xì)胞生存率均顯著下降(P<0.001)，但生存率過(guò)低，故本研究選用0.5μM和5μM用于損傷效應(yīng)評(píng)定。 3.LDH活力(U/L)：30min時(shí)對(duì)照組、0.5μM組以及5μM組LDH活力分

6、別為1226.9±248.6、1320.2±109.6、1458.6+232.6，3h時(shí)各組LDH活分別為1203.3±378.4、1306.2±248.3、1533.3±138.1，各組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；3d時(shí)5μM組(1576.0±457.1)與對(duì)照組(1184.3±118.3)比較明顯增高(P<0.05)，0.5μM組(1291.8±193.6)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，5μM組與0.5μM組比

7、較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 4.MDA濃度(μM)：30min時(shí)0.5μM組(3.79±0.06)和5μM組(3.95±0.08)與對(duì)照組(3.30±0.12)比較顯著升高(P<0.01，P<0.001)，5μM組與0.5μM組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3h時(shí)0.5μM組(4.16±0.12)和5μM組(4.77±0.12)與對(duì)照組(3.18±0.12)比較均顯著升高(P<0.001)，5μM組與0.5μM

8、組比較顯著升高(P<0.01)；3d時(shí)0.5μM組(4.28±0.18)和5μM組(5.32±0.12)與對(duì)照組(3.67±0.18)比較顯著升高(P<0.01，P<0.001)，5μM組與0.5μM組比較顯著升高(P<0.001)。 5.NO的含量(μM)：30min時(shí)0.5μM組(57.39±5.06)與對(duì)照組(56.16±6.56)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，5μM組(62.62±6.39)明顯高于對(duì)照組(P<0

9、.05)；3h時(shí)0.5μM組(68.20±8.38)和5μM組(79.00±19.99)與對(duì)照組(51.62±9.01)比較明顯升高(P<0.05，P<0.01)；30min和3h時(shí)5μM組與0.5μM組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，3d時(shí)0.5μM組(75.81±14.82)與對(duì)照組(65.87±6.76)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，5μM組(100.04±30.18)與對(duì)照組、0.5μM組比較明顯升高(P<0.01

10、，P<0.05)。 6.RAGE mRNA的表達(dá)：30min時(shí)0.5μM組(0.35±0.04)和對(duì)照組(0.40±0.05)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，5μM組(0.54±0.04)與對(duì)照組比較明顯增強(qiáng)(P<0.001)；3h時(shí)0.5μM組(0.59±0.04)與5μM組(0.82±0.08)均顯著高于對(duì)照組(0.41±0.03)(P<0.001)；3d時(shí)0.5μM組(0.89±0.09)和對(duì)照組(0.70±0.13

11、)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，5μM組(1.50±0.20)顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。各時(shí)間點(diǎn)5μM組較0.5μM組均明顯增強(qiáng)(P<0.001)，呈一定的濃度依賴(lài)性。 7.NF-kB的表達(dá)率(％)：30min時(shí)0.5μM組(4.45±0.16)和5μM組(5.25±0.66)均顯著高于對(duì)照組(2.37±0.91)(P<0.001)，5μM組與0.5μM組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3h時(shí)0.5μM組(17.1

12、0±0.85)與5μM組(19.58±0.62)均顯著高于對(duì)照組(7.61±0.23)(P<0.001)，5μM組與0.5μM組比較明顯升高(P<0.001)；3d時(shí)0.5μM組(9.03±1.05)與對(duì)照組(8.52±0.79)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，5μM組(13.47±1.07)與對(duì)照組比較及與0.5μM組比較均明顯升高(P<0.001)。 結(jié)論： 1.Aβ40在各時(shí)間點(diǎn)均能損傷內(nèi)皮細(xì)胞，表現(xiàn)在細(xì)胞生存率