雞堆型艾美耳球蟲(chóng)3-1E基因的原核表達(dá)及多克隆抗體制備.pdf

1、雞球蟲(chóng)病是危害養(yǎng)雞業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一，由球蟲(chóng)病造成的死亡和生產(chǎn)能力下降，給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)巨大損失。目前，雞球蟲(chóng)病的控制主要依賴(lài)于藥物預(yù)防和治療，由于球蟲(chóng)抗藥性而導(dǎo)致的藥物研發(fā)和使用費(fèi)用巨大，以及在治療過(guò)程中產(chǎn)生的藥殘等問(wèn)題，使藥物的使用受到限制。使用疫苗預(yù)防球蟲(chóng)病成為未來(lái)預(yù)防和控制球蟲(chóng)病的主要手段，目前利用基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)球蟲(chóng)病疫苗已成為此病的研究熱點(diǎn)，從而使球蟲(chóng)主要抗原性基因的研究顯得尤為重要。 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已發(fā)表的堆型艾美耳球蟲(chóng)(

2、E.acervulina)3-1E基因序列設(shè)計(jì)引物，用反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse-translationpolymerase-chainreaction，RT-PCR)技術(shù)擴(kuò)增出堆型艾美耳球蟲(chóng)上海株的3-1E基因，并進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果表明3-1E基因全長(zhǎng)為513bp，含有一個(gè)開(kāi)放閱讀框架。與GenBank中登錄的核苷酸序列進(jìn)行比較，E.acervulina上海株3-1E與美國(guó)株、E.tenellaGS株、E.acervuli

3、naQH株3-1E的cDNA的核苷酸同源性分別為100％、99.6％和99.2％，推導(dǎo)氨基酸同源性分別為100％、99.4％(第98位由纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼?和98.3％(第95位由蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼?，?6位由精氨酸變?yōu)楦拾彼幔?8位由纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼?。在克隆到堆型艾美耳球蟲(chóng)3-1E基因后，將此基因亞克隆至原核表達(dá)載體pET30a(+)中并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，于37℃IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得表達(dá)，表達(dá)形式為融合蛋白。凝膠薄層灰度

4、掃描顯示表達(dá)的融合蛋白約占菌體蛋白的35％。SDS-PAGE和Western-blot分析顯示，表達(dá)的3-1E融合蛋白分子量約為26Ku。利用鎳離子親和樹(shù)脂進(jìn)行純化并免疫新西蘭白兔，制備兔抗3-1E基因多克隆抗體。經(jīng)瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和Western-blot證明制備的多克隆抗體與3-1E融合蛋白具有良好的反應(yīng)性。 本實(shí)驗(yàn)成功克隆到堆型艾美耳球蟲(chóng)3-1E基因，并進(jìn)行了原核表達(dá)，利用純化的3-1E融合蛋白免疫兔制備了兔抗堆型艾美耳球蟲(chóng)3