人臍血單個(gè)核細(xì)胞移植對(duì)大鼠急性心肌梗死后心功能及左室重構(gòu)的影響.pdf_第1頁(yè)
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1、急性心肌梗死(AMI)后所造成的心肌細(xì)胞壞死和纖維疤痕形成最終將導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的左心室功能減退,這也是造成心肌梗死(MI)病人死亡和生活質(zhì)量下降的主要原因。雖然目前可實(shí)施藥物治療及早期介人干預(yù),但已丟失的心肌不能再生。近年來(lái)心肌細(xì)胞重塑為MI治療提供了一個(gè)有希望的新方法,以前所用種子細(xì)胞多來(lái)源于胚胎干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞(造血干細(xì)胞,間充質(zhì)干細(xì)胞及邊緣細(xì)胞)、骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞及胎心細(xì)胞等,最近國(guó)外亦有利用臍血干細(xì)胞做種子細(xì)胞的體內(nèi)或體外試驗(yàn)的報(bào)

2、道。臍血富含造血干細(xì)胞,同時(shí)含間充質(zhì)干細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞,且取材方便,是理想的種子細(xì)胞來(lái)源,本研究將含臍血干細(xì)胞的人臍血單個(gè)核細(xì)胞(hUCBC)注射到大鼠MI部位,觀察大鼠心功能改變及左室重構(gòu)情況。 材料和方法:1.hUCBC提取和標(biāo)記:10份臍血均來(lái)自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科,產(chǎn)婦健康。分離方法采用羥乙基淀粉(賀斯)沉淀加ficoll-paque密度梯度離心法。移植前將細(xì)胞置于含10umol/L溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)和10

3、%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基中,在37℃、飽和濕度和5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24小時(shí)行移植前細(xì)胞標(biāo)記。BrdU是DNA前體胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物,在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,BrdU可以摻入新合成的DNA鏈,通過(guò)生物素-鏈霉親和素連接的抗體及DAB系統(tǒng)顯色來(lái)檢測(cè)BrdU,定位己標(biāo)記的移植細(xì)胞。 2.動(dòng)物模型制作和細(xì)胞移植:Wistar雄性大鼠,體重150-200g,購(gòu)自中山大學(xué)動(dòng)物中心。大鼠分為三組,每組各15只,MI對(duì)照組和移植組動(dòng)物均在

4、氣管插管后行開(kāi)胸手術(shù),結(jié)扎成功后,將3×107個(gè)細(xì)胞/150ul單個(gè)核細(xì)胞懸液分三點(diǎn)注射到梗死區(qū)與正常心肌交界處,MI對(duì)照組注射等量DMEM。假手術(shù)組僅開(kāi)胸并在左前降支下過(guò)線,不結(jié)扎。 3.心功能檢測(cè):細(xì)胞注射4周后,利用超聲心動(dòng)圖行心臟檢查。超聲評(píng)價(jià)后,經(jīng)右側(cè)頸動(dòng)脈插入左心導(dǎo)管至左心室,與多導(dǎo)生理紀(jì)錄儀相連,記錄血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 4.標(biāo)本檢測(cè)及膠原密度檢測(cè):細(xì)胞移植后四周,處死動(dòng)物,取心臟標(biāo)本。沿心臟長(zhǎng)軸將心臟從心尖至

5、結(jié)扎點(diǎn)切成五片,每片厚約2mm。4%多聚甲醛固定24小時(shí),石臘包埋,5um厚連續(xù)切片,行HE染色及Masson染色以觀察心肌病理改變,同時(shí)利用圖像分析儀對(duì)非梗死區(qū)行膠原容積定量分析,以了解MI后心肌間質(zhì)膠原重構(gòu)情況。 5.標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè):為檢測(cè)移植細(xì)胞的存活性及去向,移植前細(xì)胞利用BrdU標(biāo)記。動(dòng)物處死后,取兩只大鼠心臟組織切片,用抗BrdU單克隆抗體行免疫組化染色,存活的移植細(xì)胞BrdU染色陽(yáng)性。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:測(cè)量結(jié)

6、果用-x±s表示,組間比較采用方差分析,以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SAS軟件進(jìn)行。 結(jié)果:1.一般情況:在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎復(fù)制AMI模型的手術(shù)中,動(dòng)物沒(méi)有死亡。結(jié)扎后數(shù)分鐘,即可觀察到冠狀動(dòng)脈左前降支供血區(qū)域顏色發(fā)白。但是,術(shù)后養(yǎng)殖過(guò)程中,有少數(shù)動(dòng)物死亡:移植組死亡1只,MI對(duì)照組死亡2只,假手術(shù)組死亡1只。多死于術(shù)后一周內(nèi),主要是因?yàn)槭中g(shù)創(chuàng)傷、動(dòng)物抵抗力下降所造成的胸腔感染所致,MI對(duì)照組有1只術(shù)后第30天行

7、超聲檢查時(shí),死于急性左心衰竭,表現(xiàn)為呼吸頻率明顯加快,口腔,鼻腔有大量粉紅泡沫痰涌出。 2.動(dòng)物模型評(píng)價(jià):左前降支結(jié)扎四周后,HE染色呈典型梗死的病理改變,左室前壁透壁性梗死,可見(jiàn)梗死區(qū)明顯變薄,并有大量纖維結(jié)締組織形成。 3.干細(xì)胞移植對(duì)AMI大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響見(jiàn)表1。其中LVSP、+dp/dtmax為反映左室收縮功能的指標(biāo),其值越高說(shuō)明心臟收縮功能越好;LVEDP及-dp/dtmax為反映左室舒張功能的指標(biāo),LVE

8、DP的增高及-dp/dtmax的降低表示心臟舒張功能受損。結(jié)果表明:MI對(duì)照組及移植組LVSP、±dp/dtmax均較假手術(shù)組明顯降低(P<0.01),而LVEDP較假手術(shù)組明顯升高(P<0.01),說(shuō)明心梗后大鼠收縮功能及舒張功能均受損,導(dǎo)致了心功能不全。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)經(jīng)hUCBC移植后,實(shí)驗(yàn)組LVSP、+dp/dtmax較MI對(duì)照組升高(P<0.05),說(shuō)明hUCBC心梗區(qū)移植后可使左心室收縮功能改善,而LVEDP增高幅度較MI對(duì)照組下

9、降(P<0.05),-dp/dtmax較MI對(duì)照組升高(P<0.05),則說(shuō)明hUCBC心梗區(qū)移植后可改善左心室舒張功能。 4.超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果見(jiàn)表2。其中射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率、左室后壁增厚率為反映左室收縮功能的指標(biāo),其值越大表明左室收縮功能越好。左室舒張末期內(nèi)徑、左室舒張末期容積、左室后壁厚度、梗死區(qū)室壁厚度、球形指數(shù)(舒張期左室長(zhǎng)徑/舒張期左室短徑)為反映左室形態(tài)及結(jié)構(gòu)的指標(biāo),左室舒張末期內(nèi)徑及左室舒張末期容積越大,左

10、室后壁厚度、梗死區(qū)室壁厚度及球形指數(shù)越小,提示梗死后左室重構(gòu)程度越嚴(yán)重。通過(guò)超聲心動(dòng)圖檢查,移植組和MI對(duì)照組心臟結(jié)構(gòu)與功能各指標(biāo)均較假手術(shù)組明顯惡化,但移植組較MI對(duì)照組有改善,表1可見(jiàn)移植組左室收縮功能較MI對(duì)照組提高[EF(48.96±8.80)比(37.35±10.2),P<0.05],同時(shí)移植組反映左室重構(gòu)程度的左室舒張末期內(nèi)徑亦較MI對(duì)照組有明顯縮小[(7.51±0.65)mm比(8.57±1.09)mm,P<0.05],梗

11、死區(qū)厚度增加[(6.9±1.10)mm比(5.8±1.03)mm,P<0.05]。M型超聲下:假手術(shù)組大鼠左室壁運(yùn)動(dòng)曲線波動(dòng)幅度正常,MI對(duì)照組左室壁運(yùn)動(dòng)曲線明顯變平。移植組左室壁運(yùn)動(dòng)曲線較MI對(duì)照組明顯改善,保持了較好的心功能,左室內(nèi)徑也較小,梗死區(qū)室壁較厚。 5.免疫組化染色結(jié)果:大鼠心肌Masson染色條件下膠原纖維呈藍(lán)色,胞漿、肌纖維和紅細(xì)胞呈紅色。在MI對(duì)照組,非梗死區(qū)心肌間質(zhì)膠原密度較假手術(shù)組顯著增加,心肌細(xì)胞腫脹,

12、排列紊亂。假手術(shù)組心肌細(xì)胞間僅見(jiàn)少量膠原纖維,呈條索狀與心肌纖維平行排列。移植組非梗死區(qū)心肌細(xì)胞腫脹及排列紊亂現(xiàn)象均較MI對(duì)照組改善,心肌細(xì)胞間膠原亦明顯減少。定量分析結(jié)果表明:移植組非梗死區(qū)左室心肌間膠原容積顯著降低,與MI對(duì)照組相比差異有顯著性[(6.65±2.54)cvf比(11.05±3.73)cvf,P<0.01](cvf:膠原容積分?jǐn)?shù))。抗BrdU染色后可見(jiàn)到深褐色,胞核呈BrdU染色陽(yáng)性的細(xì)胞散在分布于梗死區(qū),顯示移植的h

13、UCBC可在梗死區(qū)成活。部分染色陽(yáng)性的細(xì)胞形態(tài)呈扁平狀,參于到血管壁的組成。MI對(duì)照組梗死區(qū)及其周邊均未檢測(cè)到BrdU陽(yáng)性的移植細(xì)胞。 結(jié)論:1.本實(shí)驗(yàn)采用的動(dòng)物模型,符合AMI后左室重構(gòu)和功能障礙的基本病理特征,是研究AMI后左室重構(gòu)的病理機(jī)制和治療措施的良好實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。 2.臍血干細(xì)胞具有獨(dú)特的免疫原性,在不使用免疫抑制劑的情況下在大鼠梗死區(qū)移植,移植的細(xì)胞在宿主體內(nèi)能夠存活。 3.本試驗(yàn)顯示,臍血干細(xì)胞在

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