奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)及干細胞鑒定.pdf

1、奶牛乳腺上皮細胞（dairy cow mammary epithelial cells，DCMECs）作為常用的體外實驗工具，為奶牛乳腺發(fā)育、泌乳調(diào)控及乳腺生物反應器等方面的研究提供細胞模型。目前，DCMECs永生化細胞系的建立尚未成熟，需要在體外誘導并模擬生理條件，通過原代培養(yǎng)來獲得具有泌乳功能的分泌性乳腺上皮細胞或構建三維立體的腺泡模型。乳腺是出生后發(fā)育的器官，青春期首次快速發(fā)育及妊娠期再次發(fā)育都與乳腺干細胞（mammary ste

2、m cells，MaSCs）活躍的自我更新及分化密切相關。研究表明乳腺中存在一定比例的干細胞，但區(qū)分鑒定這些多潛能干細胞的特異性分子標志仍不十分明確。一些激素及生長因子類物質(zhì)在體內(nèi)能夠促進乳腺發(fā)育、調(diào)控泌乳，在體外能夠促進乳腺上皮細胞增殖，影響細胞黏附、遷移、伸展和分化，并且涉及到對MaSCs的調(diào)控。激素和生長因子如何影響MaSCs擴增、分化并維持其多能性，以及調(diào)控乳腺上皮細胞生長、分化參與體外立體腺泡構建的機制值得深入研究。
　

3、　本研究以原代培養(yǎng)的DCMECs為實驗模型，探討短期內(nèi)獲得大量DCMECs的方法，篩選乳腺上皮干細胞新型分子標志，鑒定奶牛乳腺上皮干細胞，觀察黃苷及IGF-Ⅰ對乳腺上皮細胞及乳腺上皮干細胞的影響。實驗中采用膠原酶消化法體外培養(yǎng)DCMECs，通過繪制細胞生長曲線、核型分析、Western Blotting檢測酪蛋白、熒光定量PCR檢測泌乳相關基因等實驗技術與方法評估原代（或傳代）細胞的生長活性與泌乳潛能;利用激光共聚焦顯微技術進行免疫熒光

4、觀察與分析，根據(jù)乳腺上皮干細胞分子標志表達、BrdU標記滯留的特點以及細胞分裂方式鑒定原代乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)體系中的乳腺上皮干細胞。
　　結果表明:
　　(1)主要成分為膠原酶Ⅳ、透明質(zhì)酸酶、DNA酶Ⅰ的消化液混合物在3h內(nèi)高效率消化組織塊，得到的原代及傳代細胞是具有60條染色體，呈現(xiàn)典型上皮細胞形態(tài)，CK18表達陽性，生長活力旺盛，能夠合成分泌β-casein的正常DCMECs，可作為后期實驗材料。
　　(2)在體

5、外培養(yǎng)過程中，通過實時熒光定量PCR方法檢測分析P0、P3、 P6、P9細胞中催乳素、生長激素和胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)及其受體基因的表達變化，經(jīng)過比較分析發(fā)現(xiàn)原代與傳代后細胞在激素、生長因子及其受體mRNA水平上差異極顯著降低（P＜0.01）。表明在非誘導泌乳分化培養(yǎng)條件下，脫離泌乳生理環(huán)境的DCMECs自身具有的泌乳調(diào)控基因表達迅速受到抑制。
　　(3)本研究根據(jù)成體干細胞具有BrdU標記滯留的特點檢測DCMECs中疑

6、似乳腺干/祖細胞，同時分析兩種新發(fā)現(xiàn)的MaSCs分子標志(FNDC3B和PROCR)的表達定位，驗證應用它們指示乳腺上皮干細胞的可行性。結果顯示，連續(xù)培養(yǎng)25d后BrdU標記滯留上皮細胞(label-retaining epithelial cells，LRECs)比例接近0.4％，極少數(shù)細胞呈FNDC3B或PROCR陽性，可以觀察到不對稱分裂細胞，但在一定培養(yǎng)時間內(nèi)，DCMECs群體中能夠保留一定比例疑似乳腺干/祖細胞，提示這些多能奶

7、牛乳腺干/祖細胞在體外泌乳調(diào)控和乳腺腺泡重塑過程中可能發(fā)揮重要作用。
　　(4)繪制細胞生長曲線，選擇對數(shù)生長期添加黃苷及IGF-Ⅰ，通過實時熒光定量PCR方法檢測分析原代及傳代細胞中催乳素、生長激素和IGF-Ⅰ及其受體的基因表達，以及干細胞分子標志FNDC3B和PROCRmRNA的表達變化。添加黃苷及IGF-Ⅰ后，P0-P9細胞PROCRmRNA的表達量顯著增高（P＜0.05），F(xiàn)NDC3B mRNA的表達量變化不顯著（P＞0.