奶牛乳腺中調(diào)控乳品質(zhì)的miRNA及其靶基因.pdf

1、奶牛的乳品質(zhì)由多因素調(diào)節(jié)控制，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)非編碼RNA可能參與奶牛的泌乳調(diào)控。
　　本研究以中國(guó)荷斯坦奶牛乳腺作為實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)用small RNA測(cè)序(small RNA-seq)技術(shù)結(jié)合RNA交聯(lián)免疫沉淀測(cè)序(CLIP-Seq)技術(shù)研究和鑒定與乳品質(zhì)相關(guān)的miRNAs和它們調(diào)控的關(guān)鍵靶基因。
　　(1)應(yīng)用small RNA-seq技術(shù)分離和鑒定與乳品質(zhì)調(diào)控相關(guān)候選miRNAs
　　本實(shí)驗(yàn)將不同乳品質(zhì)中國(guó)荷斯坦奶牛的乳

2、腺組織分為泌乳期高乳品質(zhì)實(shí)驗(yàn)組(H)和泌乳期低乳品質(zhì)實(shí)驗(yàn)組(L)，首先應(yīng)用小RNA高通量測(cè)序技術(shù)篩查不同實(shí)驗(yàn)組乳腺組織miRNAs的表達(dá)情況，同時(shí)應(yīng)用miREvo和mirDeep2這2個(gè)miRNA預(yù)測(cè)軟件對(duì)測(cè)序獲得的新序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示56個(gè)miRNA在不同乳品質(zhì)奶牛組織差異表達(dá)(P＜0.05，F(xiàn)DRq＜0.05);繼而應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)并對(duì)靶基因進(jìn)行GO和信號(hào)通路富集分析。在生物信息學(xué)靶基因篩選

3、結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)4個(gè)已報(bào)道的與乳蛋白、乳脂肪合成緊密相關(guān)的miRNA調(diào)控的靶基因CSN3、SCD、LALBA和DGAT2。預(yù)測(cè)miRNA靶基因聚集的生物學(xué)功能多數(shù)參與蛋白質(zhì)和脂肪代謝、乳腺發(fā)育分化和免疫功能，這些靶基因主要富集在MAPK信號(hào)通路、甘油磷酸脂質(zhì)代謝、缺氧誘導(dǎo)因子1和磷臘酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。結(jié)果提示調(diào)控乳品質(zhì)的miRNAs主要通過(guò)靶向糖代謝、脂肪代謝、蛋白質(zhì)代謝、細(xì)胞凋亡以及免疫相關(guān)通路的基因而發(fā)揮作用。<

4、br>　　(2)應(yīng)用RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀和CLIP-Seq技術(shù)驗(yàn)證與乳品質(zhì)相關(guān)miRNA調(diào)控的靶基因
　　為驗(yàn)證生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的乳品質(zhì)相關(guān)miRNA靶基因的結(jié)果，繼續(xù)將泌乳期高乳品質(zhì)奶牛(H)和泌乳期低乳品質(zhì)奶牛(L)的乳腺組織作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，應(yīng)用RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀技術(shù)和CLIP-Seq技術(shù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)獲得81個(gè)由miRNA調(diào)控的差異表達(dá)靶基因(P＜0.05，F(xiàn)DRq＜0.05)，同時(shí)對(duì)81個(gè)miRNA調(diào)控的差異表達(dá)

5、靶基因進(jìn)行GO分析和通路分析，結(jié)果顯示這些基因主要參與蛋白質(zhì)代謝、脂肪代謝、乳腺發(fā)育等生物過(guò)程。
　　(3)生物信息靶基因分析結(jié)果和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的整合分析
　　將生物信息靶基因分析結(jié)果和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行整合分析，共篩選到26個(gè)交集靶基因，并且對(duì)與乳脂肪和乳蛋白有關(guān)的6個(gè)基因畫(huà)了miRNA-基因-通路和miRNA-基因-功能的互作網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)其中6個(gè)靶基因（FABP3、TGFβ3、CACNA1G、ACSM1、GSS和CHAD）