小鼠甲狀腺過(guò)氧化物Phe473-Ala800多肽的表達(dá)與純化.pdf

1、自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroditis)又稱橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis,HT)是常見(jiàn)的器官特異性自身免疫病。甲狀腺過(guò)氧化物酶(thyroid peroxidase,TPO)是甲狀腺激素合成的關(guān)鍵催化酶,也是建立HT的小鼠模型—實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎(experimentalautoimmune thyroiditis,EAT)的抗原。EAT模型是誘導(dǎo)動(dòng)物甲狀腺的炎癥,模擬人的

2、自身免疫性甲狀腺炎,最常用的是小鼠模型,尤其是H-2k和H-2s單元型小鼠等有較重的甲狀腺浸潤(rùn),能更好的反應(yīng)甲狀腺炎的狀況。
　　 甲狀腺過(guò)氧化物酶(TPO)是一種糖基化血紅素蛋白,跨于甲狀腺細(xì)胞項(xiàng)緣的細(xì)胞膜上,是甲狀腺激素合成的關(guān)鍵酶,也是引起自身免疫性甲狀腺炎的一個(gè)重要自身抗原,TPO表位的異常表達(dá)或TPO和TPO抗體(TPOAb)的免疫反應(yīng),常是引起HT患者甲狀腺細(xì)胞損傷的重要機(jī)制。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)原核表達(dá)系

3、統(tǒng),表達(dá)和純化小鼠甲狀腺過(guò)氧化物酶Phe473-Ala800多肽(mouse thyroid peroxidase,mTPOF473-A800)。
　　 目的:構(gòu)建重組小鼠過(guò)氧化物酶多肽(mTPOF473-A800)原核表達(dá)載體,在Rosseta菌中誘導(dǎo)表達(dá),純化mTPOF473-A800蛋白。
　　 方法:
　　 1、提取甲狀腺組織RNA。取6只C57BL/6小鼠的甲狀腺組織,約60mg,液氮冷凍,研缽研磨組織

4、,提取總RNA。
　　 2、擴(kuò)增目的基因。RT-PCR法擴(kuò)增mTPOF473-A800基因
　　 3、克隆載體的構(gòu)建。mTPOF473-A800基因與pEASY-T3克隆載體連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞,加入含80ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基,37℃過(guò)夜培養(yǎng),次日取1ul菌液做菌液PCR,初步篩選陽(yáng)性菌株。將陽(yáng)性菌液作質(zhì)粒小提,質(zhì)粒經(jīng)EcoRI/XhoI雙酶切鑒定,挑選陽(yáng)性的重組克隆載體10ul送華大基因公

5、司測(cè)序。
　　 4、重組表達(dá)載體的構(gòu)建。pEASY-T3-mTPOF473-A800載體、pET28a、pET32a和pGEX-6p-1做EcoRI/XhoI雙酶切,后膠回收所需要的片段,經(jīng)DNA連接酶做連接反應(yīng),將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH15α感受態(tài)細(xì)胞,次日取1ul菌液做菌液PCR,初步篩選陽(yáng)性菌株。將陽(yáng)性菌液作質(zhì)粒小提,質(zhì)粒經(jīng)EcoRI/XhoI雙酶切鑒定,挑選陽(yáng)性的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E.coli Rosseta感受態(tài)細(xì)胞,做誘導(dǎo)表

6、達(dá),篩選表達(dá)量高的重組表達(dá)載體,后進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化。
　　 5、pGEX-6p-1-mTPOF473-A800的表達(dá)和GST柱純化。在最優(yōu)化的條件誘導(dǎo)表達(dá)GST-mTPOF473-A800融合蛋白,經(jīng)GST柱純化,得到mTPOF473-A800蛋白。
　　 結(jié)果:
　　 1、提取總RNA,RT-PCR PCR擴(kuò)增目的基因(mTPOF473-AS800基因),后連接到pEASY-T3克隆載體,測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增的m

7、TPOF473-A800基因序列正確。
　　 2、重組表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)條件的優(yōu)化。通過(guò)雙酶切鑒定,mTPOF473-A800基因成功連接3個(gè)表達(dá)載體。構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E.coli Rosseta感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá),pGEX-6p-1-mTPOF473-A800高效表達(dá)mTPOF473-A800蛋白,且可溶性較高。最佳誘導(dǎo)條件是:30℃、1mM IPTG。
　　 3、pGEX-6p-1-mTPOF473-