大麗輪枝菌對棉花的侵染及其轉錄組和磷酸蛋白質組學分析.pdf

1、棉花黃萎病是危害棉花最嚴重的病害之一，目前尚無有效的化學防治手段，選育抗病品種是解決棉花黃萎病最經濟有效的途徑。棉花抗黃萎病鑒定是黃萎病抗性遺傳研究和育種抗病材料篩選最關鍵的環(huán)節(jié)。然而經典的棉花黃萎病抗性鑒定方法建立在對棉花根系造成人為創(chuàng)傷后，使病原菌快速侵入維管束的基礎之上，鑒定結果受創(chuàng)傷程度，發(fā)病條件、環(huán)境因素以及操作過程等影響較大，棉花發(fā)病不一致，容易產生假抗性，影響鑒定結果的準確性。而且傳統(tǒng)的棉花黃萎病抗性鑒定需在黃萎病癥狀出現

2、后才能進行，不能觀測黃萎病病癥出現前病原菌的侵入和擴展進程。黃萎病抗性的遺傳和分子機制尚不明確，加之陸地棉抗黃萎病抗病種質匱乏，棉花抗黃萎病品種選育進展緩慢。本研究首先以具有不同抗病性的陸地棉TM-1及海島棉7124為植物材料，采用轉GFP基因的大麗輪枝菌培養(yǎng)基定量接種方法，研究大麗輪技菌的侵染機制和進程以及棉花黃萎病抗性的快速、精準鑒定方法，在此基礎上，通過棉花受大麗輪枝菌侵染后的轉錄組及磷酸蛋白質紐學研究，分析受黃萎病侵染過程中棉花

3、基因表達及蛋白質翻譯后磷酸化修飾的變化，為鑒定大麗輪枝菌侵染早期棉花抗（感）病關鍵基因和關鍵磷酸化蛋白質（位點），解析棉花感染大麗輪枝菌的分子機制提供新的線索。主要研究結果如下:
　　1、將轉GFP基因的大麗輪枝菌與培養(yǎng)基定量接種相結合，可以準確鑒定棉花黃萎病發(fā)病過程及其抗性。以轉GFP基因的大麗輪枝菌Vd991-GFP-2為病原菌，分別接種耐黃萎病的海島棉海7124和感病品種TM-1，分析大麗輪枝菌GFP熒光在棉花組織中的定殖分

4、布狀態(tài)和棉花發(fā)病情況，發(fā)現海7124體內各部分的GFP熒光強度遠低于TM-1，侵染6d后，TM-1根、莖和葉片中均檢測到GFP熒光，而海7124僅在根中可以檢測到GFP熒光，且海7124病指顯著低于TM-1，說明海7124對大麗輪枝菌具有一定的抗入侵和較強的抗擴展能力。
　　2、通過RNA-seq轉錄組測序比較接種與未接種大麗輪枝菌的陸地棉TM-1根莖的轉錄水平差異，獲得了935個差異表達基因，其中651個基因受大麗輪枝菌上調表達

5、，284基因下調表達。差異表達基因富集分析結果顯示大麗輪枝菌可以誘導苯丙氨酸代謝途徑增強、木質素累積;WRKY、MYB轉錄因子、細胞色素P450、E3泛素連接酶等基因上調表達，這些基因可能在棉花相應抗黃萎病脅迫激發(fā)棉花的抗性機制起重要作用。為進一步揭示棉花抗黃萎病分子機制提供了候選基因。
　　3、優(yōu)化建立了適宜于棉花磷酸化蛋白質提取和富集方法。比較分析了兩種不同蛋白質提取和酶切方法、三種磷酸肽富集方法、不同總蛋白量起始量以及親和色

6、譜過程中添加不同修飾性羥酸等不同因素對于磷酸肽富集數量和專一性的影響。結果表明，超濾輔助制備肽段樣品(FASP)蛋白質提取方法，以TiO2為基質的固相金屬離子親和色譜法，富集得到的磷酸肽數目最多;孵育過程中，乳酸的加入可以提高TiO2的富集效率和特異性，在一定的范圍內，富集到的磷酸肽數量與蛋白起始量成正比。
　　4、采用上述優(yōu)化的棉花磷酸化蛋白質富集方法，結合無標記(Label-free)定量方法，定性及定量的分析了接種大麗輪枝菌