滲透壓脅迫下棉花幼苗胞間液的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、干旱、鹽堿和極端溫度等外界因素引起的滲透壓脅迫是對植物生長發(fā)育影響極大的非生物脅迫之一，嚴(yán)重影響了棉花的產(chǎn)量。植物胞間液中含有眾多生理活性分子物質(zhì)，這些物質(zhì)在植物的生長、發(fā)育和環(huán)境應(yīng)答等方面都發(fā)揮著很重要的功能作用。但是胞間液提取過程中容易遭到胞質(zhì)內(nèi)成分污染，相關(guān)組分特別是蛋白成分含量極低，分離、制備較為困難，限制了對植物胞間液的深入研究。目前，植物胞間液成分特別是蛋白響應(yīng)滲透壓脅迫相關(guān)研究甚少。
　　本研究首先對前人相關(guān)方法進(jìn)行

2、改進(jìn)，建立了適合于棉花葉片胞間液的制備和胞間液蛋白提取方法；利用甘露醇模擬滲透壓環(huán)境，考察和分析了滲透壓脅迫下棉花幼苗的形態(tài)學(xué)指標(biāo)和葉片胞間液中抗氧化酶系統(tǒng)各相關(guān)酶的活性的表達(dá)；在此基礎(chǔ)上，對滲透壓脅迫下棉花幼苗胞間液進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。具體研究結(jié)果如下：
　　1、改進(jìn)了植物葉片胞間液的制備方法。在前人滲透-離心提取植物胞間液的基礎(chǔ)上，選擇了對棉花葉片較為合適的滲透緩沖液及滲透方法，通過離心得到棉花胞間液。此方法步驟簡便，用

3、時(shí)較短；提取的棉花胞間液胞內(nèi)污染較低，增加了實(shí)驗(yàn)材料的可靠性；
　　2、針對于胞間液蛋白含量較低，建立了一種適合于從極低濃度液體樣品中提取蛋白的方法。傳統(tǒng)的TCA-丙酮法不能夠很好地提取出胞間液蛋白，因此在本研究中采取了月桂酸輔佐的TCA-丙酮法提取胞間液蛋白，結(jié)果顯示：月桂酸作為蛋白沉淀載體，能夠很好地提取胞間液蛋白，且適合于后續(xù)試驗(yàn)；
　　3、考察和分析了滲透壓脅迫下棉花幼苗的形態(tài)學(xué)指標(biāo)。在脅迫處理相同時(shí)間的條件下，隨著

4、滲透壓脅迫的程度的增強(qiáng)，與對照組相比，棉花葉片葉片會出現(xiàn)不同程度的失水，處理濃度為600mM時(shí)，棉花葉片萎蔫程度相比對照較為嚴(yán)重；在同等程度脅迫處理的條件下，在處理時(shí)間0h至72h內(nèi)，與對照組相比，棉花葉片葉片會出現(xiàn)不同程度的失水，處理時(shí)長為72h時(shí)，棉花葉片萎蔫程度相比對照較為嚴(yán)重；
　　4、對滲透壓脅迫下棉花葉片胞間液中相關(guān)酶類（Superoxide dismutase，SOD；Peroxidase，POD；Catalase，

5、CAT；Ascorbate peroxidase，APOX）的活性表達(dá)進(jìn)行測定，分析表明：滲透壓脅迫會影響胞間液中相關(guān)酶類的表達(dá)。結(jié)果顯示：在滲透壓脅迫0h至60h內(nèi)，棉花胞間液中POD的表達(dá)有不同程度的下降，60h時(shí)為對照的7.8％；而CAT、APOX的表達(dá)則均有不同程度的上升，CAT和APOX表達(dá)在60h時(shí)分別為對照的120%和233%；
　　5、使用基于 O’Farrell的方法的管狀膠雙向電泳分離滲透壓脅迫下棉花葉片胞間液

6、中的蛋白，獲得了背景清晰一致的蛋白凝膠圖譜。經(jīng)PD Quest軟件分析圖譜找出差異表達(dá)的蛋白，結(jié)果顯示滲透壓脅迫下的棉花胞間液蛋白中上調(diào)表達(dá)的蛋白有9個(gè)而下調(diào)的蛋白有4個(gè)；
　　6、通過質(zhì)譜技術(shù)對棉花胞間液蛋白進(jìn)行肽指紋分析鑒定，通過Mascot數(shù)據(jù)庫同源搜索比對，共鑒定出7個(gè)胞間液蛋白，通過同源比對得到的蛋白包括β-1，3葡聚糖酶，類絲氨酸羧肽酶51，干燥相關(guān)蛋白pcC13-62，第四類幾丁質(zhì)酶和植物堿性分泌蛋白家族蛋白（BSP