嗜肺軍團(tuán)菌類真核效應(yīng)蛋白的系統(tǒng)發(fā)生及生物學(xué)功能研究.pdf

1、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)是引起嚴(yán)重非典型肺炎——軍團(tuán)病和龐蒂亞克熱的胞內(nèi)致病菌。該菌廣泛地生活在水生環(huán)境中或寄生在原生動物體內(nèi)。當(dāng)人體吸入含有嗜肺軍團(tuán)菌的氣溶膠后，該菌能到達(dá)肺部，在肺泡巨噬細(xì)胞中增殖進(jìn)而導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。嗜肺軍團(tuán)菌成功胞內(nèi)增殖的關(guān)鍵在于它能通過IVB型分泌系統(tǒng)分泌大量的效應(yīng)蛋白到宿主細(xì)胞內(nèi)，使其躲避宿主細(xì)胞早期溶酶體途徑的傷害，同時操縱宿主細(xì)胞的小泡運(yùn)輸途徑，募集內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡、線粒體和核糖

2、體等細(xì)胞器修飾利于嗜肺軍團(tuán)菌增殖的的空泡(LCV)。近年來，多項研究致力于揭示嗜肺軍團(tuán)菌效應(yīng)蛋白的功能，但由于大部分效應(yīng)蛋白具有功能冗余性的特征并且缺乏有效的檢測手段，目前對這些效應(yīng)蛋白的功能還知之甚少。遺傳背景清楚、細(xì)胞途徑保守的真核模式生物釀酒酵母和研究蛋白與蛋白相互作用的GSTpull-down技術(shù)為效應(yīng)蛋白的研究提供了新的途徑。
　　 本文對嗜肺軍團(tuán)菌編碼3個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、鞘氨醇-1-磷酸裂解酶I和類酸性神經(jīng)磷

3、脂酶的磷酸二酯酶的基因及其編碼的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探討其系統(tǒng)發(fā)生。分析結(jié)果表明：這5個基因是嗜肺軍團(tuán)菌通過基因水平轉(zhuǎn)移(HGT)的方式從其它物種獲取而來的，其中編碼的蛋白LegK1、LegK3很有可能直接源自原生動物。半定量RT-PCR結(jié)果表明lpg2137和lpg2556在指數(shù)生長后期大量表達(dá)，而lpg2588和lpg2176在指數(shù)生長前期大量表達(dá)，分別提示他們在感染期和復(fù)制期發(fā)揮功能。
　　 利用釀酒酵母作為替代宿主的

4、生長抑制實(shí)驗(yàn)表明，在37℃生長條件下，用低拷貝質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中表達(dá)LegK3引起了較弱的酵母生長抑制現(xiàn)象。在酵母細(xì)胞內(nèi)的共定位分析發(fā)現(xiàn)，LegK3與肌動蛋白細(xì)胞骨架和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的小泡均出現(xiàn)了共定位現(xiàn)象，表明LegK3在酵母細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)可能是細(xì)胞骨架和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)小泡。
　　 通過大腸桿菌BL21(DE3)成功表達(dá)GST-LegK1、GST-LegK2、GST-LegK3和GST-LegS1，并純化得到GST-Le

5、gK2、GST-LegK3和GST-LegS1。以GST-LegK3為誘餌蛋白，通過GST pull-down從人肺泡巨噬細(xì)胞U937細(xì)胞總蛋白中篩選到一個靶標(biāo)蛋白，經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定為肌動蛋白，進(jìn)一步證實(shí)了LegK3的靶標(biāo)是細(xì)胞骨架。
　　 此外，本文還對嗜肺軍團(tuán)菌的一個LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子lpg0173與抗氧化功能、上游基因的調(diào)控關(guān)系、以及對嗜肺軍團(tuán)菌胞內(nèi)增殖能力和細(xì)胞毒性的影響進(jìn)行研究。結(jié)果表明，野生型Lp