抑瘤素M對(duì)C3H10T1-2增殖及成骨分化的影響.pdf

1、[目的]
　　1.白介素-6(IL-6)家族蛋白因子抑瘤素M(OSM)對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞系增殖的作用。
　　2.白介素-6(IL-6)家族蛋白因子抑瘤素M(OSM)對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞系成骨分化的影響。
　　3.白介素-6(IL-6)家族蛋白因子抑瘤素M(OSM)對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞系成骨分化過程中礦化的作用。
　　[方法]
　　1、用含不同濃度OSM的基礎(chǔ)培養(yǎng)液(0、5、10、20、40、8

2、0ng/ml)分組體外培養(yǎng)小鼠胚胎源性間充質(zhì)干細(xì)胞(C3H10T1/2)，于48h、72h用MTS檢測(cè)法檢測(cè)不同濃度OSM對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞體外增殖效率的影響。2、體外擴(kuò)增細(xì)胞后，將C3H10T1/2細(xì)胞以1×105/ml接種于6孔板，每孔1ml細(xì)胞懸液，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)足至2ml，培養(yǎng)24h至細(xì)胞貼壁后換液。將24塊6孔板分為4組，每組6塊作同樣處理，4組分別是:(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基組（陰性對(duì)照）;(2)成骨誘導(dǎo)液組（陽性對(duì)照）;(3

3、)OSM(20ng/ml)組;(4)實(shí)驗(yàn)組(成骨誘導(dǎo)液+OSM(20ng/ml))。3d、1w、2w、3w各組取一塊板提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，2w、3w每組另取一塊板提取總蛋白，以PCR法及Western-Blot法檢測(cè)相關(guān)成骨基因及礦化基因的表達(dá)。3、取5塊96孔板，將細(xì)胞以1×105/ml接種于96孔板，每板使用16孔，每組設(shè)置4個(gè)孔，每孔100ul，實(shí)驗(yàn)分組及OSM濃度同6孔板。1w、2w、3w每組各取一板檢測(cè)堿性磷酸酶(AL

4、P)相對(duì)活性，2w、3w每組各取一板用茜素紅染色法行鈣定量分析，同時(shí)檢測(cè)成骨礦化結(jié)節(jié)的形成，以此驗(yàn)證OSM對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化及礦化的影響。以上實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)。
　　[結(jié)果]
　　1.MTS法檢測(cè)不同濃度OSM對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞增殖效率的影響:含不同濃度OSM的培養(yǎng)基作用于細(xì)胞后，與對(duì)照組比較，在48h、72h都檢測(cè)到不同濃度的OSM對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞均有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)當(dāng)O

5、SM濃度為20ng/ml時(shí)增值效率最高，48h和72h20ng/ml OSM細(xì)胞增值率達(dá)到148％和166％，20ng/ml組與其他各濃度組之間細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　2.RT-PCR法檢測(cè)成骨相關(guān)基因表達(dá):半定量檢測(cè)成骨相關(guān)基因如骨形成蛋白2(BMP2)、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)、SP7轉(zhuǎn)錄因子(SP7)、ALP、同源轉(zhuǎn)錄因子5(DLX5)、1型膠原(COL-1)、骨粘連蛋白(ON)、骨涎蛋白(BS

6、P)、骨鈣蛋白(OC)、骨橋蛋白(OPN)等的表達(dá)。BMP-2、RUNX2、DLX5、OC、ON、BSP、COL-1、SP7均從1w末開始表達(dá)上調(diào)，持續(xù)高表達(dá)至第三周;ALP及OPN從1w末開始高表達(dá)并達(dá)到峰值，隨后時(shí)間點(diǎn)表達(dá)下調(diào)，但仍高于對(duì)照組;實(shí)驗(yàn)組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+成骨誘導(dǎo)液+OSM)在設(shè)定檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的成骨基因表達(dá)與其他對(duì)照組均之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　3.Western-Blot法檢測(cè)成骨蛋白表達(dá):在2w、

7、3w時(shí)檢測(cè)成骨蛋白表達(dá)，在第2周和第3周均可見實(shí)驗(yàn)組COL-I、OPN、BSP及OC蛋白相對(duì)含量均明顯高于其他各對(duì)照組。
　　4.堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定:接種C3H10T1/2于96孔板，分別于1、2、3w以酶標(biāo)法檢測(cè)堿性磷酸酶ALP的活性。驗(yàn)組及OSM組于第1周ALP相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高值，隨后表達(dá)下降;陽性對(duì)照組ALP相對(duì)表達(dá)量于第2周達(dá)峰值，各實(shí)驗(yàn)組相對(duì)陰性對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　5.鈣染色與相對(duì)鈣

8、定量檢測(cè):接種C3H10T1/2于96孔板，分別于2w、3w檢測(cè)各分組鈣染色、礦化結(jié)節(jié)形成及鈣定量分析。實(shí)驗(yàn)組在2w和3w相對(duì)鈣定量分別達(dá)到陰性對(duì)照組8倍和40倍，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;陽性對(duì)照組及OSM組在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)鈣定量分析與陰性對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);分別于2w、3w用茜素紅染色法檢測(cè)各分組鈣染色及礦化結(jié)節(jié)形成，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組從第2周開始形成少量鈣結(jié)節(jié)，第3周可見視野中大量鈣結(jié)節(jié)形成;其余組2w和3w時(shí)