三分三托品烷生物堿代謝工程.pdf

1、托品烷生物堿是一類在莨菪、顛茄、曼陀羅等茄科植物中廣泛存在的次生代謝物。它作為抗膽堿藥在臨床上被廣泛應(yīng)用，主要作用于副交感神經(jīng)系統(tǒng)，具有麻醉、解痙、止痛等功能。莨菪堿（hyoscyamine）和東莨菪堿（scopolamine）是兩種被廣泛使用的托品烷生物堿。 三分三（Anisodus acutangulus）是我國特有產(chǎn)托品烷生物堿的資源植物，在云南民間已經(jīng)有數(shù)百年的使用歷史，其干燥品總生物堿含量高達(dá)1.2％。三分三生物堿含量

2、比世界上常見的一些茄科植物如顛茄、莨菪、曼陀羅等都要高的多，所以對其進(jìn)行基因工程方面的研究具有重要價值。 本研究以三分三為材料，RACE法克隆托品烷生物堿代謝關(guān)鍵酶基因，托品酮還原酶Ⅰ（AatrⅠ，GenBank Accession No.EU424321）和托品酮還原酶Ⅱ（AatrⅡ，GenBank Accession No.EU424322）。AatrⅠcDNA全長1188bp，包含822bp的開放閱讀框，編碼273個氨基酸

3、；AatrⅡcDNA全長1116bp，包含783bp的開放閱讀框，編碼260個氨基酸。氨基酸多重序列比對結(jié)果顯示AatrⅠ和AatrⅡ分別與其他茄科植物的AatrⅠ和AatⅡ有更高的同源關(guān)系，但是彼此之間只有60.8％的同源性。進(jìn)化樹表明，AatrⅠ和AatrⅡ分屬于不同的進(jìn)化簇。組織表達(dá)分析表明AatrⅠ和AatrⅡ都能在根莖葉中表達(dá)，但是AatrⅠ表達(dá)水平明顯比AatrⅡ低。甲基茉莉酸（MeJA）誘導(dǎo)實驗表明，AatrⅠ幾乎不被Me

4、JA誘導(dǎo)；而AatrⅡ被MeJA誘導(dǎo)強烈。 本研究還用AatrⅠ和Aah6h（三分三莨菪堿6β—羥化酶基因）分別構(gòu)建了單基因表達(dá)載體pCAMBIA1304++AatrⅠ和雙基因表達(dá)載體pCAMBIA1304++AatrⅠ+Aah6h，用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1介導(dǎo)轉(zhuǎn)化三分三外植體，獲得了轉(zhuǎn)基因毛狀根。結(jié)果顯示，較對照組毛狀根，trⅠ單基因轉(zhuǎn)化毛狀根莨菪堿含量提高了87％，東莨菪堿含量提高至原來的8倍；trⅠ&h6h雙基因轉(zhuǎn)化毛狀根莨