新生鼠皮膚表皮細(xì)胞牙源性上皮方向分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、牙齒的發(fā)生和發(fā)育是由上皮和間充質(zhì)在一系列信號(hào)分子組成的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的精確調(diào)控下完成的。因此牙齒的生物性再生至少需要兩種細(xì)胞：上皮源性細(xì)胞和間充質(zhì)源性細(xì)胞。目前牙源性間充質(zhì)細(xì)胞的替代研究進(jìn)展較快而且取得了可喜的成績(jī)，例如成體的牙髓干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞均被證明具有形成牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的功能。在尋找牙源性上皮細(xì)胞替代細(xì)胞方面雖然也進(jìn)行了一些研究，如誘導(dǎo)胚胎時(shí)期口腔粘膜上皮或皮膚表皮以及成體骨髓來(lái)源的細(xì)胞向成釉細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但這些研究多建立在應(yīng)用胚胎

2、早期組織基礎(chǔ)之上，以出生后組織為來(lái)源尋找替代細(xì)胞的研究進(jìn)展有限。尋找能夠向牙源性上皮方向分化的成體或出生后組織來(lái)源的細(xì)胞對(duì)解決牙齒再生研究中上皮源性種子細(xì)胞來(lái)源的瓶頸問(wèn)題具有重要意義。本研究著重探討出生后1d 仔鼠的皮膚來(lái)源的表皮細(xì)胞向牙源性上皮方向分化以及參與牙齒發(fā)育的能力。本課題主要進(jìn)行了以下幾方面的研究： 1. 牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞對(duì)皮膚表皮細(xì)胞牙向分化的體外誘導(dǎo)研究 （1）皮膚表皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定以出生1d

3、的SD 仔鼠背部皮膚為組織來(lái)源進(jìn)行表皮細(xì)胞培養(yǎng)。采用胞外基質(zhì)的黏附法對(duì)原代培養(yǎng)的表皮細(xì)胞進(jìn)行篩選，對(duì)篩選細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞表型以及細(xì)胞周期的特性進(jìn)行分析。 結(jié)果表明所經(jīng)傳代培養(yǎng)所得到的細(xì)胞具有良好的生物學(xué)特性，能夠表達(dá)表皮干細(xì)胞相對(duì)特異性標(biāo)識(shí)物CK19、CK14；流式細(xì)胞周期分析顯示所培養(yǎng)的細(xì)胞多數(shù)處于G0/G1 期。上述檢測(cè)結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的表皮細(xì)胞中未分化細(xì)胞的含量較多。 （2）牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)采

4、用顯微分離法分離出生后1d SD仔鼠下頜第一磨牙的牙乳頭，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明分離獲得的牙乳頭組織中沒(méi)有牙源性上皮的殘余。采用酶消化法進(jìn)行牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞（DPMCs）的原代培養(yǎng)并對(duì)細(xì)胞的純度、表型、增殖能力以及礦化能力等特性進(jìn)行分析。 結(jié)果表明分離培養(yǎng)的DPMCs 沒(méi)有上皮性標(biāo)記物pan-CKs 的表達(dá)，但卻能夠穩(wěn)定的表達(dá)VIM，RT-PCR 分析顯示所培養(yǎng)的DPMCs 沒(méi)有牙源性上皮特異性基因AMGN、AMBN 的表達(dá)

5、。進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果表明DPMCs 具有較強(qiáng)的增殖能力和礦化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后分泌礦化基質(zhì)的能力。結(jié)果證明本研究所獲得的DPMCs 沒(méi)有上皮細(xì)胞污染、具有較強(qiáng)增殖活性和礦化能力。 （3）牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞對(duì)表皮細(xì)胞牙向分化的體外誘導(dǎo)研究通過(guò)分層培養(yǎng)建立牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞對(duì)表皮細(xì)胞牙向分化的體外誘導(dǎo)模型，以牙胚細(xì)胞條件培養(yǎng)液為輔助誘導(dǎo)液對(duì)表皮細(xì)胞進(jìn)行牙向分化誘導(dǎo)。結(jié)果表明經(jīng)過(guò)體外6d 的培養(yǎng),表皮細(xì)胞能夠表達(dá)牙源性上皮標(biāo)記物AMBN,AMGN

6、 基因。進(jìn)一步免疫細(xì)胞化學(xué)染色分析表明這些細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)CK14，從而說(shuō)明在該誘導(dǎo)條件下表皮細(xì)胞能夠向牙源性上皮方向分化而不是向角質(zhì)細(xì)胞方向分化。該誘導(dǎo)方案的建立為尋找非牙源性上皮細(xì)胞替代牙源性上皮細(xì)胞的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 2. 牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞對(duì)皮膚表皮細(xì)胞牙向分化的體內(nèi)誘導(dǎo)研究 （1）表皮細(xì)胞與牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)模式的篩選建立了間充質(zhì)細(xì)胞團(tuán)塊與表皮皮片、間充質(zhì)細(xì)胞與表皮細(xì)胞混合接種支架材料、間充質(zhì)細(xì)

7、胞團(tuán)塊與表皮細(xì)胞團(tuán)塊分層組合、間充質(zhì)細(xì)胞與表皮細(xì)胞混合細(xì)胞團(tuán)塊4 種不同的牙齒再生上皮-間充質(zhì)間的重組方案，培養(yǎng)14d 后的結(jié)果表明間充質(zhì)與表皮細(xì)胞混合團(tuán)塊培養(yǎng)體系中可以觀察到類牙齒樣結(jié)構(gòu)，而其他三組中均無(wú)此類結(jié)構(gòu)的形成。本實(shí)驗(yàn)最終篩選間充質(zhì)細(xì)胞與表皮細(xì)胞混合團(tuán)塊體內(nèi)培養(yǎng)的方法作為皮膚表皮細(xì)胞與牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞相互作用的體內(nèi)誘導(dǎo)模式。 （2）牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞對(duì)表皮細(xì)胞牙向分化的體內(nèi)誘導(dǎo)研究采用間充質(zhì)細(xì)胞與表皮細(xì)胞/組織混合團(tuán)塊

8、體內(nèi)培養(yǎng)的重組方案，分別將出生1d 仔鼠的表皮皮片/細(xì)胞與原代的DPMCs 按1;2 的體積比混合重組后形成細(xì)胞團(tuán)塊，同時(shí)設(shè)立單純的皮膚表皮皮片、表皮細(xì)胞和單純的牙乳頭間充質(zhì)組織、DPMCs移植作為陰性對(duì)照。體內(nèi)培養(yǎng)14d 后進(jìn)行組織學(xué)、免疫組織化學(xué)分析，結(jié)構(gòu)顯示，表皮皮片與DPMCs 的重組體中可見(jiàn)由釉質(zhì)、成釉細(xì)胞、牙本質(zhì)、前期牙本質(zhì)已及成牙本質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的不規(guī)則的牙齒樣結(jié)構(gòu)，表皮細(xì)胞與DPMCs 形成的重組體中可見(jiàn)具有一定牙冠形態(tài)的牙

9、胚樣結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步免疫組織化學(xué)染色分析和PKH26 熒光標(biāo)記均顯示釉質(zhì)形成細(xì)胞為皮膚來(lái)源的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)首次證明了來(lái)自出生后1d 的SD 仔鼠皮膚的表皮細(xì)胞在一定的誘導(dǎo)條件下能夠向牙源性上皮方向轉(zhuǎn)化，同時(shí)還證明了本研究中所采用的誘導(dǎo)方法能夠有效的促進(jìn)皮膚表皮細(xì)胞向牙源性上皮方向轉(zhuǎn)化。 （3）牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞對(duì)出生后不同時(shí)間點(diǎn)皮膚表皮牙向分化的體內(nèi)誘導(dǎo)研究分別取出生后4d、7d 的仔鼠的背部表皮，將其與出生1d 的仔鼠的DPMCs

10、混合制備成細(xì)胞團(tuán)塊，經(jīng)體內(nèi)培養(yǎng)后進(jìn)行組織學(xué)觀察。結(jié)果表明2 組重組體中均無(wú)釉質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的形成。本實(shí)驗(yàn)表明在同1d 仔鼠表皮相同的誘導(dǎo)條件下，4d 及7d 仔鼠的表皮不具備向牙源性上皮方向轉(zhuǎn)化的能力。 3. 牙髓間充質(zhì)對(duì)皮膚表皮細(xì)胞牙向分化的體內(nèi)誘導(dǎo)研究 （1）牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞與牙髓干細(xì)胞生物學(xué)行為及成牙本質(zhì)能力的比較研究采用有酶消化法及有限稀釋的方法進(jìn)行大鼠牙髓干細(xì)胞（DPSCs）的原代培養(yǎng)，并將所獲得的DPSCs 與

11、DPMCs 進(jìn)行增殖能力、體外礦化能力、體內(nèi)形成牙本質(zhì)能力的比較，結(jié)果顯示DPSCs 具有與DPMCs 相似的增殖能力、礦化和形成牙本質(zhì)的能力。 （2）牙髓間充質(zhì)對(duì)出生1 天仔鼠皮膚表皮細(xì)胞牙向分化的體內(nèi)誘導(dǎo)研究通過(guò)分別建立牙髓干細(xì)胞、牙髓中1/3、牙髓根尖1/3 組織與出生1d 仔鼠表皮細(xì)胞的重組體觀察牙髓間充質(zhì)對(duì)表皮來(lái)源細(xì)胞牙源性上皮方向分化的誘導(dǎo)能力。將上述重組體體內(nèi)培養(yǎng)14d 后組織學(xué)結(jié)果顯示3 組中均無(wú)牙釉質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的

12、形成。本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明雖然牙髓間充質(zhì)來(lái)源于牙胚間充質(zhì)且具有同DPMCs 相似的形成牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體的能力，但在對(duì)非牙源性上皮牙向分化誘導(dǎo)能力方面存在較大差異。 綜上所述，本研究首次證明了出生后1d SD 仔鼠皮膚來(lái)源的表皮細(xì)胞在出生后1d 的SD 仔鼠的DPMCs 的誘導(dǎo)下能夠向牙源性上皮方向分化。相同的誘導(dǎo)模式下，牙髓間充質(zhì)的誘導(dǎo)不能使皮膚來(lái)源的表皮細(xì)胞實(shí)現(xiàn)牙向分化。 本研究為牙齒再生研究走向臨床奠定良好的實(shí)驗(yàn)