T細胞受體δ2鏈互補決定區(qū)（CDR）3與抗原結合的分子結構基礎—一個利用細胞膜表達不同CDR3δ移植型TCRγδ技術的研究例證.pdf

1、晚近，固有免疫中的細胞成分-γδT細胞在抗感染免疫、腫瘤免疫、免疫調節(jié)以及自身免疫等方面的重要作用廣受關注。然而，與承擔特異性細胞免疫功能、MHC-抗原肽-TCRαβ三元體結構解析較為清楚的αβT細胞形成鮮明對比的是，免疫學術界對γδT細胞受體(TCRγδ)識別抗原的結構基礎所知甚少，同時TCRγδ所識別的抗原鑒定工作也進展緩慢。 研究表明，TCRγδ鏈，尤其是TCRδ鏈上的互補決定區(qū)(CDR3)是與抗原表位結合的關鍵部位。近年

2、來，我們實驗室選擇TCRδ2鏈的CDR3(CDR3δ)為研究對象，在CDR3合成多肽、CDR3移植性Ig與腫瘤靶細胞、靶組織以及腫瘤細胞提取蛋白的相互作用機制方面做了大量的工作，驗證了CDR3δ是’FCRδ2鏈與抗原結合的關鍵部位。為了更真實地反應TCRγδ的結合活性，本研究中，我們通過TCRγδ重建技術，構建了一個利用細胞膜表達不同CDR3δ移植型TCRγδ異質二聚體的技術體系，來研究CDR3δ與抗原特異性結合的分子結構基礎。另一方面

3、，該技術體系也為尋找γδT細胞的抗原表位提供新的方法。 本文的主要工作及學術成果如下： 一、CDR3δ與抗原結合的分子結構基礎 1.構建了CDR3區(qū)移植型TCRγδ轉染細胞系 將嵌合了特異性CDR3區(qū)序列的全長γ9和δ2鏈共轉染J.RT3-T3.5細胞，使其細胞膜表面表達TCRγδ，構建了CDR3區(qū)移植型TCRγδ轉染細胞系。這種TCRγδ轉染細胞系能夠模擬γδT細胞特異性識別抗原。 2.TCRγ

4、δ識別抗原的關鍵部位是CDR38 我們構建了卵巢癌TIL中δ2的特異性CDR3序列OT3移植型TCRγδ轉染細胞系，命名為OT3γδTCR細胞。OT3γδTCR細胞在多種腫瘤細胞的刺激作用后，活化分泌IL-2。同時，這種活化作用能被抗TCRγδ的單克隆抗體所阻斷。OT3γδTCR細胞對多種腫瘤細胞也具有細胞毒作用，殺傷活性也能被抗TCRγδ的單克隆抗體所阻斷。另外，γ9鏈和OT3δ2鏈共轉染及單獨的OT3δ2鏈轉染的細胞在腫瘤抗

5、原刺激后IL-2的表達沒有差異，提示TCRγδ與腫瘤抗原的結合主要依賴TCRδ2鏈。OT3γδTCR細胞與腫瘤抗原的反應性高于無關CDR3序列對照轉染細胞(即兩種細胞表達的TCR具有相同的γ9鏈和攜帶不同CDR3區(qū)序列的δ2鏈)。這些結果進一步證實，OT3γδTCR細胞能夠模擬γδT細胞特異性識別腫瘤細胞抗原，并且TCRγδ識別抗原的過程中CDR3δ起著關鍵的作用。 3.CDR3δ的側翼序列是抗原結合特異性的關鍵決定簇

6、為了進一步探討CDR3δ與配體作用的分子結構基礎，我們將OT3的V、D和J區(qū)突變體相對應的核甘酸序列嵌入到完整的δ2鏈中，與相同的γ9鏈共轉染，構建各個突變體轉染細胞，分別命名為VmOT3γδTCR、DmOT3γδTCR和JmOT3γδTCR細胞。在γδTCR表達率相同的前提下，比較各個轉染細胞與腫瘤細胞的反應性。結果顯示，VmOT3γδTCR細胞和JmOT3γδTCR細胞在HO8910、Hela和SKOV3細胞總蛋白及HSP70、hM

7、SH2N端蛋白(MNS)和C端蛋白(MCS)刺激作用下，細胞活化表達IL-2的量要遠遠低于OT3γδTCR細胞的，而DmOT3γδTCR細胞表達IL-2的量降低不明顯。同時，在不同的效靶比時，VmOT3γδTCR細胞和JmOT3γδTCR細胞對SKOV3細胞的殺傷作用遠遠低于OT3γδTCR細胞的，而DmOT3γδTCR細胞的殺傷活性降低不明顯。這一結果與我們實驗室前期用OT3突變肽檢測與腫瘤細胞的結合特性相吻合，進一步提示，正是側翼序

8、列(V和J)決定了TCRδ2-CDR3與靶細胞的結合。 4.CDR3δ97位的疏水性氨基酸在識別非肽抗原和蛋白抗原方面的差異 我們用相同的方法也構建了OT10γδTCR轉染細胞，OT10是在δ97位具有疏水性氨基酸的CDR3δ序列。非肽抗原刺激OT10γδTCR細胞能分泌IL-2，而當用點突變的方法將δ97的異亮氨酸(I)突變成同樣疏水性氨基酸亮氨酸(L)以及酸性氨基酸天冬氨酸(D)和羥基類氨基酸絲氨酸(S)后，這些突變

9、體轉染細胞在非肽抗原刺激作用后IL-2的表達量有所差異。突變成亮氨酸后，IL-2的表達量下降不明顯，而突變成另外兩種氨基酸后，其IL-2的表達量降低明顯或幾乎沒有。實驗結果進一步說明δ97位置的疏水性氨基酸對于非肽抗原的識別至關重要。但是，δ97位的氨基酸突變卻不能改變轉染細胞對SKOV3細胞總蛋白的識別。提示CDR3δ97位的疏水性氨基酸在識別非肽抗原和蛋白抗原方面存在差異。 二、以OT3γδTCR細胞系為探針，利用差異篩選的

10、方法在噬菌體隨機展示肽庫中進行抗原表位篩選 以OT3γδTCR細胞作為探針，用差異篩選的方法，在噬菌體十二肽庫中，篩選TCRγδ特異結合的十二肽，得到了兩條優(yōu)勢序列。人工合成的優(yōu)勢十二肽的結合特性分析與體外功能實驗，證明這兩條十二肽都可為OT3γδTCR所識別，提示可能是其抗原表位。這一實驗結果證明我們的策略是可行的。 本研究通過結構生物學手段進一步驗證了CDR3δ在抗原結合中所起的關鍵作用，即CDR3δ決定抗原結合的特

11、異性。我們所取得重要創(chuàng)新性科學發(fā)現為，首次發(fā)現CDR3δ側翼序列的V和J片段決定CDR3δ與配體的結合特異性。由于CDR3δ側翼序列在結構上是呈現的保守特點，故在理論上推測其CDR3δ側翼序列只能與結構同樣保守的蛋白多肽序列結合。在此意義上說，TCRγδ所識別的配體是結構保守和數量有限的。因此，這一發(fā)現為TCRγδ識別抗原的有限多樣性提供了強有力的結構生物學證據。 我們還首次創(chuàng)立了OT3γδTCR細胞作為探針，以差異篩選的方法，

12、在噬菌體十二肽庫中篩選TCRγδ特異結合的十二肽的新策略，并且通過實驗驗證了這一策略是可行的。利用這一策略將為γδT細胞所識別的腫瘤抗原表位或腫瘤相關抗原表位的發(fā)現提供新思路和技術支持，進而為腫瘤的診斷、免疫治療提供更多更的生物標記物或治療靶點，為圍繞γδT細胞所進行的腫瘤治療的應用開發(fā)奠定堅實的基礎。 此外，實驗中我們還發(fā)現了新的人NKG2D的功能性配體，即ULBP4的三個剪切變體(ULBP4-Ⅰ、ULBP4-Ⅱ和ULBP4-