刺頭復(fù)葉耳蕨的藥學(xué)及其抗腫瘤作用機制研究.pdf

1、刺頭復(fù)葉耳蕨(Arachniodes exilis Ching)是鱗毛蕨科復(fù)葉耳蕨屬植物，在我國主要分布于長江流域以南地區(qū)及山東、河南等省，民間習(xí)用其根莖入藥。目前，國內(nèi)外對其所含化學(xué)成分和生物活性的研究報道很少，本研究對刺頭復(fù)葉耳蕨進行了生藥學(xué)、總黃酮部位提取純化工藝、抗腫瘤作用等研究，并初步制定了刺頭復(fù)葉耳蕨藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為規(guī)范其使用及進一步研究刺頭復(fù)葉耳蕨的生物活性、開發(fā)其藥用價值提供了基礎(chǔ)。
　　在生藥學(xué)研究中，分別從基

2、源、性狀、顯微特征方面對刺頭復(fù)葉耳蕨進行了系統(tǒng)的鑒別研究，并對其進行了化學(xué)成份系統(tǒng)預(yù)試及紫外吸收特征考察等研究。從顯微鑒別結(jié)果分析，刺頭復(fù)葉耳蕨葉柄橫切面的組織結(jié)構(gòu)特殊，從葉柄橫切面可觀察到分體中樞為5，維管組織有限外韌型，其中三個分體中樞環(huán)列，2個分體中樞較大，形態(tài)各異，在其木質(zhì)部形成明顯具拖尾的喇叭形，對于刺頭復(fù)葉耳蕨的鑒定有較好的科學(xué)意義；化學(xué)成份系統(tǒng)預(yù)試結(jié)果表明，刺頭復(fù)葉耳蕨中含有黃酮類化合物、酚性化合物、萜類、還原糖等化學(xué)成份

3、，不含有皂苷和生物堿；在單一紫外譜線組法鑒別中草藥的基礎(chǔ)上，利用刺頭復(fù)葉耳蕨不同極性溶劑萃取部位的紫外掃描譜線相結(jié)合來表達其特征。
　　本研究采用超聲波輔助乙醇提取法對刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮提取工藝進行研究，在單因素試驗基礎(chǔ)上進行了提取條件正交試驗；并采用聚酰胺樹脂純化法，建立了其總黃酮的純化工藝。所得最佳提取工藝為：溶劑為60％乙醇，料液比為1:20，超聲波輔助提取3次，每次提取30min。所得最佳純化工藝為：上樣液濃度為2.0mg

4、/ml，上樣液pH值為5，以70％乙醇為洗脫劑，洗脫速度為2.0 BV/h。
　　本研究對刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮進行了體外抗腫瘤活性的研究。結(jié)果表明其可抑制人肝癌HepG2及肺癌A549細(xì)胞的增殖，其活性優(yōu)于刺頭復(fù)葉耳蕨總提取物，其中對人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制率最高。在此基礎(chǔ)上，以人肝癌HepG2細(xì)胞為模型，采用Hoechst33258熒光染色法和Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡等方法來進一步研究刺頭復(fù)葉耳蕨總黃

5、酮體外抗腫瘤作用。結(jié)果表明其可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而對HepG2細(xì)胞的生長增殖產(chǎn)生抑制作用。同時，采用流式細(xì)胞術(shù)、免疫印跡實驗等方法對其誘導(dǎo) HepG2細(xì)胞凋亡的機制進行了探討，結(jié)果顯示其能引起細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的異常升高，線粒體內(nèi)膜電位(MMP)的顯著降低，細(xì)胞色素C(cytochrome c)的大量釋放，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下調(diào)、促凋亡蛋白Bax表達顯著上調(diào)，cleaved caspase-9、-3蛋白表達水平明顯升高，P

6、ARP蛋白的表達水平明顯降低，MAPK信號傳導(dǎo)通路JNK、P38 MAPK發(fā)生磷酸化激活；ROS捕獲劑NAC、特異性P38抑制劑SB203580、特異性JNK抑制劑SP600125均能顯著逆轉(zhuǎn)復(fù)葉耳蕨總黃酮誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)分子事件。結(jié)果表明刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的過程中，過多生成的ROS氧化應(yīng)激激活JNK和P38 MAPK激酶通路，繼而活化caspases級聯(lián)并調(diào)控Bcl-2家族，共同促進細(xì)胞凋亡的發(fā)生。