木質(zhì)纖維素水解組分對細菌纖維素合成的影響.pdf

1、細菌纖維素（Bacterial Cellulose，簡稱BC）是一類由微生物生產(chǎn)的具有獨特納米三維網(wǎng)絡結構的纖維素。它具有高比表面積，高純度、高聚合度、高持水性、高結晶度、高抗張強度和良好的生物相容性等優(yōu)異性能。作為一種新型的生物材料，BC在紡織、造紙、生物醫(yī)學工程、功能材料和食品工業(yè)中具有廣泛的應用前景，是目前國際生物材料研究的熱點之一。制約BC大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的主要因素是生產(chǎn)成本高、產(chǎn)率低。用價格低廉、來源廣、可再生性的農(nóng)林固體廢棄物

2、等木質(zhì)纖維素原料制備BC，有望降低BC的生產(chǎn)成本。
　　木質(zhì)纖維素通過預處理水解生成可發(fā)酵性糖，通常需要高溫高壓酸水解。然而在處理過程中產(chǎn)生了多種抑制微生物生長代謝的化合物，主要包括有機酸（甲酸、乙酸和乙酰丙酸）、呋喃衍生物（糠醛和5-羥甲基糠醛）、芳香族化合物等。這些物質(zhì)的種類及含量與原料的種類、預處理條件等密切相關。在以水解物為發(fā)酵碳源時，這些化合物不僅抑制微生物的生長代謝，而且影響微生物對水解液中糖的轉(zhuǎn)化利用。目前，對這些水

3、解組分的研究主要集中在利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的領域，譬如這些化合物對乙醇酵母的生長和乙醇發(fā)酵的影響上，而關于其對于木醋桿菌等細菌發(fā)酵生產(chǎn)BC的影響則未見任何報道。因此，本文針對BC的合成機制，研究木質(zhì)纖維素水解液中主要的糖類、有機酸類、呋喃醛類和芳香族類化合物對木醋桿菌合成 BC的影響，包括菌體自身的生長代謝、培養(yǎng)基中生物轉(zhuǎn)化物質(zhì)的測定、培養(yǎng)基中 pH值的變化、碳源的消耗以及 BC的產(chǎn)量。通過對研究結果的分析，結合菌體的代謝途徑，找

4、出起主要抑制作用的化合物，探討了這些物質(zhì)對于BC合成的影響機理。并在研究的過程中建立了一種新型的快速檢測細菌活性狀態(tài)數(shù)量的熒光染色方法。
　　本文的主要研究內(nèi)容和結果如下：
　　1.開發(fā)了一種可以快速檢測培養(yǎng)液中細菌細胞活性狀態(tài)的試劑盒，直觀簡便。試劑盒含有兩種熒光染料，分別是花菁染料 SYBR GreenⅠ和碘化丙啶（PI）。兩種染料的最佳染色濃度分別為4μM和10μg/mL，最佳染色時間為15 min。將染色的木醋桿菌的

5、熒光強度與所檢測的菌濃制成雙對數(shù)曲線，其線性關系良好，且相關系數(shù)R2均大于0.98。根據(jù)概率統(tǒng)計中的t分布，當α=0.05，計算其置信區(qū)間，得出利用此曲線時所檢測的菌體濃度范圍需要控制在106至108 cells/mL之間。利用該方法測得木醋桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的相對活度％live bacteria(x)與Ratio G/R(y)呈線性關系，與Invitrogen公司市售試劑盒LIVE/DEAD? BaclightTM Bac

6、terial Viability Kit L7012所檢測的結果區(qū)別不大。對同一樣品進行檢測，熒光染色法比傳統(tǒng)的涂平板法檢測結果會高一個數(shù)量級，但是兩者有很好的相關性，相關系數(shù)r2為0.9967。經(jīng)嘗試，該方法不能用于酵母染色。
　　2.以木質(zhì)纖維素水解液中普遍存在的D-葡萄糖，D-木糖，D-甘露糖，D-半乳糖，L-阿拉伯糖，D-阿拉伯糖和常用碳源D-果糖七種糖類作為碳源，在25 g/L和100 g/L兩種濃度下研究比較了對木醋桿

7、菌和紅茶菌兩種菌株生產(chǎn)BC的影響。結果發(fā)現(xiàn)D-果糖對兩種菌種都是最合適的碳源。木醋桿菌能夠利用D-木糖和D-半乳糖生產(chǎn)BC。紅茶菌能大量消耗D-甘露糖，但是其BC的得率僅有0.1 g/g，消耗的D-甘露糖主要用于菌體自身的生長及其他代謝目的。這是首次發(fā)現(xiàn)紅茶菌能夠利用D-甘露糖，而 D-甘露糖在水解液中是很難被其他微生物利用的單糖之一。實驗所得的BC的結晶度比較高，均高于73.2%。經(jīng)過 SEM檢測發(fā)現(xiàn)兩類微生物生產(chǎn)的細菌纖維素的平均直

8、徑差異不大。
　　3.在培養(yǎng)基中分別添加木質(zhì)纖維素水解液中常見的三種有機酸化合物（甲酸、乙酸和乙酰丙酸），研究其對木醋桿菌生長代謝和BC合成的影響。結果發(fā)現(xiàn)，甲酸對于菌體的抑制作用最強，且這三種有機酸對于木醋桿菌的抑制作用強度從大到小的排序為甲酸>乙酸>乙酰丙酸。木醋桿菌能夠耐受培養(yǎng)基中25 mM的甲酸，當甲酸濃度高于100 mM時，菌體的生長受到明顯抑制，且測不到BC的產(chǎn)量。乙酸對于菌體的抑制作用不明顯,在加入乙酸的培養(yǎng)基中其

9、BC產(chǎn)量與空白培養(yǎng)基中的沒有明顯變化。當培養(yǎng)基中乙酸的初始濃度低于175 mM時，木醋桿菌能夠代謝乙酸。木醋桿菌不能代謝利用乙酰丙酸，低濃度的乙酰丙酸能夠促進木醋桿菌的生長并有利于BC的生產(chǎn)。在含有初始濃度為100 mM的乙酰丙酸的培養(yǎng)基中，所得的BC的產(chǎn)量為5 g/L，高于空白培養(yǎng)基中的產(chǎn)量3.5 g/L。甲酸對于木醋桿菌的強抑制作用機理可以用陰離子的富集理論來解釋。
　　4.在培養(yǎng)基中分別添加木質(zhì)纖維素水解液中常見的兩種呋喃醛

10、類化合物（糠醛和5-羥甲基糠醛），研究其對木醋桿菌生長代謝和BC合成的影響。結果發(fā)現(xiàn)，糠醛比5-羥甲基糠醛對于木醋桿菌的抑制作用更大。20 mM的糠醛可明顯抑制木醋桿菌，而30 mM的5-羥甲基糠醛才會對木醋桿菌產(chǎn)生相同的抑制作用。木醋桿菌能夠?qū)⒌蜐舛瓤啡┺D(zhuǎn)化為糠酸。當糠醛初始濃度為10 mM時，糠醛的轉(zhuǎn)化效率最高，可達到88%。低濃度的5-羥甲基糠醛可提升BC的產(chǎn)量,木醋桿菌可將5-羥甲基糠醛轉(zhuǎn)化為5-羥甲基-2-糠酸。當5-羥甲基糠

11、醛的初始濃度為10 mM時，5-羥甲基糠酸的產(chǎn)量最高，可達76%。培養(yǎng)過程中，木醋桿菌對于呋喃醛物質(zhì)進行的生物氧化還原反應可以看成是一種生物脫毒過程。
　　5.在培養(yǎng)基中分別添加木質(zhì)纖維素水解液中常見的四種芳香族類化合物（松柏醛，阿魏酸，香草醛，4-羥基苯甲酸），研究其對于木醋桿菌的生長代謝和BC合成的影響。結果發(fā)現(xiàn)，松柏醛和香草醛對于木醋桿菌的抑制作用最強。當培養(yǎng)基中松柏醛的初始濃度為2.0 mM時，能夠完全抑制培養(yǎng)基中菌體的生

12、長代謝。當其濃度低于1.5 mM時，大部分松柏醛可被轉(zhuǎn)化成阿魏酸和少量的松伯醇。實驗發(fā)現(xiàn)與松柏醛有著相似分子結構的阿魏酸，在添加相同濃度（0~2 mM）下對于木醋桿菌的生長具有一定促進作用，但是未明顯影響B(tài)C的產(chǎn)量。當香草醛的濃度達到2.5 mM或更高時，木醋桿菌的生長代謝和BC的合成均受到較強抑制。而當香草醛初始濃度低于2.5 mM時，其可被轉(zhuǎn)化成香草醇和少量香草酸。木醋桿菌不能代謝4-羥基苯甲酸。該酚酸對木醋桿菌的增殖和葡萄糖的消耗

13、速率均無明顯影響,但是對于BC的合成具有一定的抑制。結果表明酚醛類物質(zhì)比酚酸類物質(zhì)具有更大的抑制作用。
　　通過以上幾部分的研究發(fā)現(xiàn)，木醋桿菌和紅茶菌能夠利用木質(zhì)纖維素水解液中大部分的可發(fā)酵糖作為碳源生產(chǎn)細菌纖維素，這些糖類物質(zhì)進入菌體后參與的代謝網(wǎng)絡的差異可能導致菌體對于不同單糖的利用效率不同。水解液中的芳香族化合物對于木醋桿菌的抑制作用明顯大于有機酸和呋喃醛。木醋桿菌對于有機酸有較高的耐受性，對于低濃度的酚醛類和呋喃醛類化合物