Lactobacillus helveticus H9全基因組測(cè)序及蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、Lactobacillus helveticus H9(LABCC IMAU60208)和Lactobacillus helveticus H10（LABCC IMAU60227）是由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從中國(guó)西藏采集樣品中分離鑒定得到，于乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)保藏。經(jīng)篩選及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Lactobacillus helveticus H9是一株蛋白水解活性較強(qiáng)，可發(fā)酵脫脂乳產(chǎn)生具有潛在降血壓活

2、性肽類物質(zhì)的菌株；Lactobacillus helveticus H10也是一株蛋白水解活性較強(qiáng)，但是在發(fā)酵乳的過程中不產(chǎn)生具有降血壓活性的肽類物質(zhì)。
　　為了探尋了解Lactobacillus helveticus H9發(fā)酵乳可以產(chǎn)生具有ACE抑制活性的物質(zhì)的途徑和機(jī)理，本研究采用全基因組測(cè)序和蛋白質(zhì)組學(xué)研究相結(jié)合的方法進(jìn)行研究分析。
　　采用Roche454和Illumina Solexa兩種高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定了菌株H

3、9和對(duì)照菌株H10的全基因組序列，并且進(jìn)行了比較基因組學(xué)研究，重點(diǎn)分析了乳酸菌蛋白水解系統(tǒng)的相關(guān)信息。基因組測(cè)序結(jié)果表明Lactobacillus helveticus H9和Lactobacillus helveticus H10染色體基因組均為閉合環(huán)狀分子，染色體長(zhǎng)度分別為1,871,119bp和2,145,899bp，通過序列預(yù)測(cè)分析分別得到1815和2049個(gè)開放閱讀框。通過 COG功能分類和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Lactobacil

4、lus helveticus H9糖代謝、氨基酸代謝、蛋白水解系統(tǒng)、核酸代謝進(jìn)行了分析，同時(shí)分析了菌株產(chǎn)胞外多糖的能力、CRISPR基因簇、插入序列等。利用比較基因組學(xué)研究對(duì)菌株H9、H10和DPC4571的蛋白水解系統(tǒng)進(jìn)行了詳盡的分析，通過分析表明細(xì)胞壁蛋白水解酶PrtH、胞內(nèi)肽酶PepN、PepO和PepX是菌株產(chǎn)ACE抑制肽的關(guān)鍵酶。
　　采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)和方法，構(gòu)建了Lactobacillus helveticus

5、H9在乳中發(fā)酵不同生長(zhǎng)時(shí)期的蛋白質(zhì)組參考圖譜，分析菌株在不同生長(zhǎng)時(shí)期的蛋白質(zhì)表達(dá)情況，重點(diǎn)對(duì)在后兩個(gè)時(shí)期表達(dá)的乳酸菌蛋白水解系統(tǒng)的相關(guān)蛋白進(jìn)行了分析。通過二維凝膠電泳圖譜得到菌株在三個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的蛋白斑點(diǎn)數(shù)，分別為729（發(fā)酵初期）、1020（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）和925個(gè)（穩(wěn)定期）。利用質(zhì)譜鑒定其中差異蛋白點(diǎn)275個(gè)，其中233個(gè)鑒定成功，對(duì)鑒定成功的蛋白點(diǎn)進(jìn)行了COG功能分類，主要是與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和合成相關(guān)蛋白；核酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝相關(guān)蛋白；碳

6、水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝相關(guān)蛋白；氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝相關(guān)蛋白等。其中與蛋白水解系統(tǒng)相關(guān)的蛋白PepN、PepE、PepO2以及OppC是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期都表達(dá)的蛋白，這與發(fā)酵試驗(yàn)中在這兩個(gè)時(shí)期可以檢測(cè)到ACE抑制活性的結(jié)果相一致，所以我們初步推測(cè)Opp轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是菌株在乳中生長(zhǎng)利用乳蛋白所必須的，PepN、PepO2以及PepE可能與菌株在發(fā)酵乳的過程中產(chǎn)ACE抑制肽具有相關(guān)性。
　　采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)全面分析了Lactobac

7、illus helveticus H9在乳中生長(zhǎng)的三個(gè)階段蛋白水解系統(tǒng)相關(guān)酶基因的表達(dá)變化情況，同時(shí)還對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中出現(xiàn)的部分蛋白點(diǎn)進(jìn)行了基因表達(dá)驗(yàn)證。
　　該研究項(xiàng)目的實(shí)施和完成，使我們?nèi)嬲J(rèn)識(shí)了Lactobacillus helveticus H9的全基因組信息，有助于我們對(duì)該菌株及瑞士乳桿菌的蛋白水解系統(tǒng)進(jìn)一步的了解，同時(shí)掌握了該菌株在乳中發(fā)酵生長(zhǎng)過程中蛋白質(zhì)的組成以及表達(dá)規(guī)律，進(jìn)而為探索乳酸菌產(chǎn)生ACE抑制肽的機(jī)制提供