金屬硫蛋白抗阿霉素心臟毒性作用的基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、阿霉素(Doxorubicin，DOX)屬葸醌類(lèi)化合物，是臨床上常用的廣譜、高效抗腫瘤藥物，廣泛用于急慢性白血病及各種實(shí)體瘤的治療。然而，DOX具有明顯的心臟毒性，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。因此，探討DOX所致心臟毒性的機(jī)制，尋找有效的防護(hù)措施和拮抗藥物，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)是一類(lèi)富含還原型半胱氨酸殘基的低分子量非酶蛋白，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的各種器官和組織中，參與體內(nèi)許多生理及病理

2、過(guò)程。有報(bào)道表明，MT能拮抗電離輻射、炎癥、感染、藥物毒副作用等因素所致的損傷，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)機(jī)體組織細(xì)胞具有保護(hù)作用，是一種內(nèi)源性的細(xì)胞保護(hù)物質(zhì)，但其保護(hù)作用機(jī)制仍不十分清楚。機(jī)體內(nèi)MT主要與Zn<'2+>、Cd<'2+>、Cu<'2+>等二價(jià)金屬離子絡(luò)合，能廣泛地被重金屬、炎癥、休克、饑餓、電離輻射、抗癌藥物等因素誘導(dǎo)表達(dá)。其中鋅(Zn)屬高效而且安全的MT誘導(dǎo)劑，較低劑量的Zn即可有效誘導(dǎo)MT的表達(dá)。近年來(lái)，應(yīng)用基因敲除技術(shù)建

3、立的MT基因缺失小鼠動(dòng)物模型為研究生物體內(nèi)MT的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制提供了有力工具。 本課題利用MT-Ⅰ/Ⅱ基因敲除型小鼠(MT-/-)和野生型小鼠(MT+/+)，通過(guò)Zn預(yù)處理的方式，建立MT的三種表達(dá)水平模型(即缺失一生理表達(dá)量一高表達(dá))，觀(guān)察MT不同表達(dá)水平對(duì)DOX所致心臟毒性損傷的影響，探討MT是否對(duì)DOX心臟毒性損傷具有保護(hù)作用以及可能的作用機(jī)制。在傳統(tǒng)毒性機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，本研究聯(lián)合基因組學(xué)技術(shù)和蛋白組學(xué)技術(shù)，從整

4、體水平上分析DOX給藥后MT+/+小鼠與MT-/-小鼠心臟組織相關(guān)基因/蛋白質(zhì)的變化情況，從基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的角度探討MT拮抗DOX心臟毒性損傷的可能作用機(jī)制，并試圖尋找在MT發(fā)揮對(duì)DOX心臟毒性拮抗作用中可能起重要作用的關(guān)鍵蛋白，為臨床上合理使用DOX以及開(kāi)發(fā)DOX心臟毒性保護(hù)劑提供理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)DOX(15 mg/kg，i．p．)能引起MT+/+小鼠及MT-/-小鼠心臟明顯的毒性損傷，表現(xiàn)為血漿CK及LDH活性升高、cTnT含量增加

5、、心肌組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病理學(xué)改變、心臟組織脂質(zhì)過(guò)氧化，且這些毒性表現(xiàn)在MT-/-小鼠比MT+/+小鼠更為嚴(yán)重。連續(xù)2天給予Zn預(yù)處理(300μmol/kg，s．c．，每天一次)能顯著提高M(jìn)T+/+小鼠心臟組織中MT水平(相當(dāng)于對(duì)照組的25倍)，且Zn預(yù)處理誘導(dǎo)的MT高表達(dá)明顯抑制了DOX引起的MT+/+小鼠心臟毒性損傷。MT-/-小鼠經(jīng)Zn預(yù)處理后未見(jiàn)其心臟組織中MT水平有明顯改變，對(duì)DOX誘發(fā)的心臟毒性損傷無(wú)拮抗作用。以上結(jié)果提示，MT對(duì)

6、DOX心臟毒性損傷具有保護(hù)效應(yīng)，且在此保護(hù)效應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的可能是MT，而不是Zn本身。本研究還發(fā)現(xiàn)，DOX給藥后心臟組織O<,2>含量升高且3-NT呈彌漫性強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)，而Zn誘導(dǎo)的MT高表達(dá)則可抑制DOX引起的O<,2>生成的增加和3-NT的表達(dá)增高；提示由O<,2>生成增加導(dǎo)致的ONOO<'->水平升高可能參與了DOX心臟毒性作用過(guò)程，而MT對(duì)心臟的保護(hù)作用的機(jī)制之一可能是MT對(duì)ONOO<'->生成的抑制作用，從而減少了ONOO<

7、'->引發(fā)的心肌細(xì)胞毒性損傷。即MT可能是通過(guò)其清除自由基的功能從而發(fā)揮對(duì)DOX心臟毒性的拮抗作用。 利用小鼠全基因組表達(dá)譜芯片GeneChip Mouse Genome 430 2.0對(duì)MT+/+小鼠和MT-/-小鼠給予DOX后心臟全基因組表達(dá)譜的改變進(jìn)行研究的結(jié)果表明：①生理狀態(tài)下，MT-/-小鼠心臟組織與MT+/+小鼠相比有10個(gè)差異表達(dá)基因(fold change>2或<0．5)，這些基因可能對(duì)細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互

8、作用以及Jak-STAT生物學(xué)通路有影響，提示正常狀態(tài)下兩種小鼠對(duì)外界刺激的應(yīng)激能力可能就有差異，因而導(dǎo)致對(duì)應(yīng)激損傷的反應(yīng)不同。②DOX給藥后MT-/-小鼠與MT+/+小鼠心臟組織差異表達(dá)基因?yàn)?0個(gè)，其中有8個(gè)編碼細(xì)胞膜組分，7個(gè)編碼線(xiàn)粒體組分，3個(gè)編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分，提示細(xì)胞質(zhì)膜、線(xiàn)粒體以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷可能是MT發(fā)揮心臟保護(hù)效應(yīng)的調(diào)控環(huán)節(jié)。50個(gè)差異表達(dá)基因中包括解偶聯(lián)蛋白3(ucp3)，鈣網(wǎng)蛋白3(calr3)，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)

9、移酶l家族(ugt1)，peroxiredoxin 2 (prdx2)等，提示拮抗自由基引起的氧化應(yīng)激、糾正鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、以及減弱機(jī)體對(duì)毒物的代謝活化等可能是MT發(fā)揮對(duì)DOX心臟毒性拮抗作用的調(diào)控環(huán)節(jié)。③將MT-/-小鼠與MT+/+小鼠在給予DOX前后的差異表達(dá)基因進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有483個(gè)基因的變化趨勢(shì)不同；其GO分子功能的類(lèi)別主要集中于蛋白結(jié)合、金屬離子結(jié)合(尤其是鋅離子結(jié)合與鈣離子結(jié)合)、DNA結(jié)合、受體活性、激酶活性、ATP

10、結(jié)合、水解酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性以及轉(zhuǎn)錄因子活性等。其相關(guān)的生物學(xué)通路包括有關(guān)氨基酸代謝、核苷酸代謝、糖代謝、脂肪酸代謝、氧化磷酸化、谷胱甘肽代謝、細(xì)胞色素P450對(duì)外來(lái)化合物的代謝等，提示這些基因及生物學(xué)通路可能與MT發(fā)揮對(duì)DOX心臟毒性的拮抗效應(yīng)有關(guān)。 利用雙向凝膠電泳技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)MT+/+小鼠與MT-/-小鼠給予DOX后心臟組織總蛋白的改變進(jìn)行研究，共鑒定出13個(gè)差異表達(dá)蛋白，分別是乙酰輔酶A脫氫酶短鏈和中鏈、異戊酰輔酶A

11、脫氫酶、Peroxiredoxin家族3和6、抑制素、α-B晶狀體球蛋白、ATP合成酶、泛醇-細(xì)胞色素C還原酶核心蛋白1、肌球蛋白輕鏈4、磷酸丙糖異構(gòu)酶1、烯醇酶3以及ES1蛋白。其功能主要集中在脂肪酸代謝、糖酵解和糖異生、電子傳遞呼吸鏈、細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)以及心肌結(jié)構(gòu)蛋白。采用’Western blot對(duì)典型的差異蛋白——抑制素的表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示與蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.991。13個(gè)差異表達(dá)蛋白中，Peroxir