鱈魚(yú)皮多肽的制備及活性研究.pdf

1、本研究以鱈魚(yú)皮為原料，測(cè)定其基本營(yíng)養(yǎng)成分，采用響應(yīng)面法對(duì)木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶三種酶進(jìn)行多肽提取過(guò)程酶解工藝優(yōu)化。同時(shí)分別對(duì)其進(jìn)行了薄層層析法（TLC）的初步優(yōu)化及分析。酶解液經(jīng)離心沉淀、微濾后，進(jìn)行真空冷凍干燥。采用超臨界 CO2萃取法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行脫腥處理。對(duì)得到的不同分子量肽段的梯級(jí)肽進(jìn)行化學(xué)抗氧化性研究，最后以得率和活性為導(dǎo)向進(jìn)行多肽的分離純化。
　　主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　1.鱈魚(yú)皮基本營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

2、>　　鱈魚(yú)皮作為一種廉價(jià)而大量的海產(chǎn)品下腳料，不僅蛋白含量豐富，粗蛋白含量高達(dá)31.65％，脂肪含量較低，僅為1.92%，同時(shí)由于其粗蛋白中膠原蛋白含量極高，可用于制備膠原蛋白肽。
　　2.鱈魚(yú)皮可控酶解技術(shù)優(yōu)化及薄層層析
　　首先，考慮到方便實(shí)際生產(chǎn)、安全、產(chǎn)品風(fēng)味等因素選擇三種最適pH為中性的蛋白酶：木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶作為實(shí)驗(yàn)用酶，考察料水比、酶解溫度、反應(yīng)時(shí)間和加酶量四個(gè)因素對(duì)單酶水解效果的影響并進(jìn)行優(yōu)

3、化，利用響應(yīng)面法確定最優(yōu)工藝。
　　然后利用薄層層析對(duì)酶解液產(chǎn)物進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)三種蛋白酶酶解液Rf值有所不同，木瓜：0.054，0.140，0.237，0.344，0.376，0.419；風(fēng)味：0.054，0.129，0.215，0.323，0.366，0.398；復(fù)合：0.065，0.140，0.237，0.280，0.323，0.344，0.387。通過(guò)對(duì)Rf值的比較可以對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行初步分析，三種蛋白酶的Rf值有重合的，

4、說(shuō)明它們可能酶解出相同的肽，而由于酶切位點(diǎn)的不同等原因，使得它們酶解產(chǎn)生了不同的產(chǎn)物。
　　利用雙酶酶解法對(duì)酶解條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。最后確定最佳酶解條件為：在料水比為1:6，總加酶量為15mg/mL，兩種酶比例為2:1，先在53℃加木瓜蛋白酶酶解2h之后，再在46℃加入復(fù)合蛋白酶酶解2h，酶解效果最好，其水解度達(dá)到24.67%。
　　3.超臨界CO2法脫腥和感官評(píng)價(jià)
　　本實(shí)驗(yàn)利用超臨界 CO2法來(lái)去除鱈魚(yú)皮膠原蛋白的

5、腥味物質(zhì)，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化超臨界萃取工藝，以電子鼻檢測(cè)超臨界萃取脫腥后的樣品，結(jié)合感官評(píng)價(jià)法對(duì)樣品腥味進(jìn)行區(qū)分。電子鼻檢測(cè)結(jié)果表明：線性判別分析(LDA)方法可以很好的將不同的樣品區(qū)分開(kāi)。同時(shí)，結(jié)合感官評(píng)價(jià)對(duì)樣品氣味進(jìn)行考察，因此使用電子鼻可以區(qū)分不同超臨界萃取條件脫除鱈魚(yú)皮膠原蛋白腥味的樣品。
　　結(jié)果表明：超臨界萃取可以有效脫除鱈魚(yú)皮膠原蛋白腥味，經(jīng)過(guò)超臨界萃取后的樣品與超臨界萃取前原料的腥味明顯不同，正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出最佳超臨界

6、萃取脫腥工藝條件，在壓力為V2，溫度為T(mén)3，時(shí)間為H1時(shí)，樣品腥味最小。
　　4.梯級(jí)肽的制備及活性研究
　　本實(shí)驗(yàn)采用了超濾法對(duì)梯級(jí)肽進(jìn)行分離制備，采用了梯度稀釋法對(duì)超濾過(guò)程進(jìn)行控制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)四次超濾，小于截留分子量的多肽已基本進(jìn)入到濾過(guò)液中，達(dá)到了肽段分離的目的。本次試驗(yàn)共得到四個(gè)分子量范圍的多肽，即T0：分子質(zhì)量＞10kDa的物質(zhì)，T1：5-10kDa的肽段，T2：1-5kDa的肽段，T3：＜1kDa的肽段。

7、木瓜、復(fù)合、風(fēng)味和雙酶酶解液經(jīng)過(guò)超濾后得到的T3含量分別為89.89%、87.82%、81.89%和92.03%。這說(shuō)明雙酶酶解法比單酶法不僅水解度要高，制備的小分子肽也多，因此，以雙酶法作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備多肽是可行的。
　　對(duì)雙酶酶解液的T1、T2、T3進(jìn)行化學(xué)抗氧化性的測(cè)定結(jié)果顯示：T1、T2、T3均具有較好的清除DPPH、超氧陰離子和羥自由基能力，且清除效果在一定范圍內(nèi)與濃度成正相關(guān)。其中，T3對(duì)清除DPPH、超氧陰離子和羥自

8、由基能力的能力要優(yōu)于T1和T2，T1和T2清除超氧陰離子能力無(wú)明顯差別，但清除羥自由基能力T1比T2要好。
　　5.鱈魚(yú)皮多肽純化及理化分析
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高速逆流色譜，對(duì)超濾得到的肽段T3進(jìn)行進(jìn)一步純化分離，通過(guò)選擇合適的溶劑體系（甲基叔丁基醚：正丁醇：乙腈：1%三氟乙酸=2:1:1:5），將T3肽段的四個(gè)峰進(jìn)行分離，并測(cè)定其在濃度為15mg/mL時(shí)清除自由基能力。其中清除抗超氧陰離子自由基能力F4的清除能力要高于其他組分