重組狂犬病病毒的拯救及其礦化疫苗的生物學特性研究.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)感染引起的以侵犯中樞神經系統(tǒng)為主的致死性人畜共患傳染病。RABV可以感染人及所有溫血動物，引起狂犬病，一旦發(fā)病致死率幾乎可達100％。
　　本研究利用反向遺傳操作，通過將綠色熒光蛋白(GFP)基因克隆到狂犬病病毒載體的N和P基因之間，并且在Vero E6細胞上進行重組病毒拯救，成功的拯救出攜帶GFP基因的重組狂犬病病毒rSAD-GFP，并對重組病毒的生物學特性進行了研究。通

2、過測定病毒滴度，繪制生長曲線，病毒滴度測定結果表明重組病毒與親本病毒在Vero E6細胞的生長特性基本一致，兩種病毒生長沒有顯著性差異;重組病毒在Vero細胞連續(xù)傳代數代，未發(fā)現外源基因丟失的現象。將拯救的重組病毒rSAD-GFP通過腦內注射的方法感染BALB/C小鼠，通過該試驗評價重組病毒的致病性，小鼠在重組病毒攻擊后，無可見的臨床癥狀和死亡現象，表明拯救的重組病毒屬于弱毒毒株。在構建rSAD-GFP毒株成功的基礎上，我們利用該質粒，

3、構建含有礦化基因W6的重組質粒，并對外源礦化基因的插入位置進行了一系列的研究，獲得了不同的重組質粒，轉染Vero E6細胞，但是未能拯救成功。該礦化基因插入位置對病毒的拯救存在影響，而狂犬病毒含有囊膜，也是拯救過程中的一個障礙，并且有研究發(fā)現連續(xù)的天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)存在導致的強負電荷性多肽插入困難，這種情況下病毒也很難拯救成功。
　　介孔納米二氧化硅是一種外表有很多像蜂巢孔一樣的小孔，中間卻是空心的，類似蜂巢狀的結構使得

4、二氧化硅顆?？梢酝ㄟ^氫鍵、離子鍵作用、靜電作用、疏水作用力與蛋白質結合，介孔二氧化硅可以負載病毒抗原，保護病毒抗原。本研究試圖將介孔納米二氧化硅作為體外礦化候選佐劑，將重組狂犬病病毒rSAD-GFP滅活抗原與介孔納米二氧化硅按一定的比例混合，研究介孔二氧化硅作為疫苗佐劑對重組狂犬病疫苗的理化性質的影響，并通過M-ABT（抗原含量測定方法）檢測疫苗中糖蛋白含量變化。
　　利用BALB/C小鼠模型進一步評價重組病毒滅活抗原的免疫效價和

5、以介孔納米二氧化硅為佐劑的疫苗免疫特性。ELISA法檢測血清抗RABV G蛋白IgG抗體，RFFIT檢測血清中和抗體。同時，取21和28日齡的小鼠脾臟用于ELISPOT以分析IL-4和IFN-γ的分泌水平;在28天用30個LD50的CVS對小鼠進行腦內攻毒，評價疫苗保護效力，結果顯示介孔納米二氧化硅佐劑可以有效誘導細胞免疫和體液免疫。攻毒保護試驗結果顯示單純的抗原保護率可以達到70％，與佐劑混合的抗原保護率可以達到100％。介孔納米Si