M型磷脂酶A2受體抗體高靈敏定量方法的研制及在膜性腎病診斷中的應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　建立抗PLA2R抗體的超靈敏定量檢測方法，改進抗PLA2R抗體檢測在特發(fā)性膜性腎病、繼發(fā)性膜性腎病乃至其他腎病中的應(yīng)用。
　　內(nèi)容:
　　(1)重組PLA2R的表達、純化和鑒定。
　　(2)抗PLA2R抗體的定量標準品的制備。
　　(3) Eu3+標記抗人IgG抗體的制備。
　　(4)建立抗PLA2R抗體時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）檢測方法，并進行反應(yīng)條件的優(yōu)化選擇和方法學(xué)的評估。<

2、br>　　(5)將此技術(shù)應(yīng)用于膜性腎病的研究，是否可以準確的評估抗PLA2R抗體在特發(fā)性膜性腎病、繼發(fā)性膜性腎病乃至其他腎病中的應(yīng)用價值，是否可能通過不同的閾值對膜性腎病的程度和類型進行區(qū)分。
　　方法:
　　(1)采用帶有flag標簽的PLA2R質(zhì)粒進行重組PLA2R的表達、用偶聯(lián)有flag抗體的柱料進行純化、鑒定重組PLA2R的分子量和免疫反應(yīng)活性。
　　(2)篩選出一個含高濃度抗PLA2R抗體的血清，采用尿素解離

3、結(jié)合在PLA2R包被孔上的抗PLA2R抗體，并進行IgG抗體定量，推算出原血清中抗PLA2R抗體的濃度，將此已知抗PLA2R抗體濃度的樣品稀釋到不同濃度作為抗PLA2R抗體的標準品。
　　(3)建立抗PLA2R抗體TRFIA檢測方法，并從包被濃度的選擇、標記抗體稀釋度的選擇、血清稀釋度的選擇、反應(yīng)時間的選擇等各方面進行了優(yōu)化。從批內(nèi)批間精密度、靈敏度、回收率、測量范圍等方面對建立的TRFIA方法進行評價。
　　(4)用建立的

4、TRFIA試劑盒檢測167腎病患者（其中特發(fā)性模性腎病77例，IgA腎病53例，紅斑狼瘡腎病16例，其它腎病21例）血清及286例健康體檢者血清中PLA2R自身抗體濃度，進行參考范圍的建立和診斷價值分析。
　　創(chuàng)新性成果:
　　(1)制備了具有特異性免疫反應(yīng)活性的重組PLA2R抗原，可用于抗PLA2R抗體的檢測。
　　(2)制備了抗PLA2R抗體標準品，為抗PLA2R抗體檢測的量化提供了依據(jù)。設(shè)置的抗PLA2R抗體的標

5、準品濃度分別為0μg/ml、0.17μg/ml、0.68μg/ml、3.42μg/ml、17.1μg/ml、68.4μg/ml、343μg/ml。
　　(3)目前抗PLA2R抗體的血清學(xué)檢測尚處于理論研究階段，主要采用western-blot方法，少數(shù)研究者采用間接免疫熒光法和ELISA方法，但這些方法靈敏度有限，主要用于定性或半定量分析，而且操作復(fù)雜費時，另外目前還沒有商品化的抗PLA2R抗體的定量檢測試劑盒。本研究建立的TRF

6、IA方法檢測抗PLA2R抗體具有良好的檢測性能，其靈敏度為0.02μg/ml，檢測上限為343μg/ml，有效檢測范圍為0.02μg/mL～343μg/ml，3份標本的回收率均值為98.96％，批內(nèi)CV％(n=20)分別為6.38％、5.55％、4.88％，批間(n=8)CV％分別為7.69％、6.23％、6％，均＜10％。本研究意義在于為膜性腎病患者提供一個除穿刺以外的可臨床實際應(yīng)用的血清學(xué)診斷指標，為該病的診斷、活動性的判斷、治療時

7、機的把握、藥物的選擇及療效判斷提供一個理想的血清學(xué)標志物。使該病情的診斷和監(jiān)控更為方便，患者容易接受，有利于特發(fā)性膜性腎病的早期診斷和治療。
　　(4)通過設(shè)定不同的閾值可以將正常人、IgA腎病、紅斑狼瘡腎病、IMN、其它腎病進行區(qū)分，0～0.91μg/ml為正常參考值，35.8％的IgA腎病、50％的紅斑狼瘡腎病、14.3％其它腎病、88.3％的IMN的抗PLA2R抗體的值＞0.91μg/ml，IMN的檢測特異性為90.9％;若