高變區(qū)1抑制丙型肝炎病毒包膜蛋白E2誘生交叉中和抗體.pdf

1、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）屬于黃病毒科，主要經(jīng)血液傳播，是引起人類丙型肝炎的病原體。全球約有1.7億人感染HCV，每年新增感染者達(dá)300萬(wàn)-400萬(wàn)。我國(guó)HCV感染者估計(jì)近4000萬(wàn)。HCV感染易慢性化，其慢性化率可高達(dá)85％，部分慢性丙型肝炎患者可發(fā)展為肝硬化，甚至肝細(xì)胞癌。目前主要采用聚乙二醇干擾素α聯(lián)合利巴韋林治療丙型肝炎，其效果明顯受HCV基因型影響。2、3型HCV感染對(duì)該療法的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率（

2、SVR）可達(dá)到75％，但1型HCV感染的SVR不到50％。目前全球范圍內(nèi)經(jīng)血液以及血制品途徑感染的丙型肝炎病例與上世紀(jì)九十年代以前相比有大幅下降，但在發(fā)展中國(guó)家血液和血制品仍然是傳播HCV的重要途徑。此外，每年散發(fā)性以及傳播途徑不明的丙型肝炎新發(fā)病例仍高居不下?？刂艸CV感染的關(guān)鍵措施還是依賴于開(kāi)發(fā)出有效的疫苗，從1989年HCV基因組被克隆以來(lái)，丙型肝炎疫苗的研究在歐美和日本等發(fā)達(dá)國(guó)家一直是研究熱點(diǎn)，但迄今未有有效的疫苗問(wèn)世。

3、　　 HCV包膜蛋白E2位于HCV蛋白前體第384-746位氨基酸殘基，由一個(gè)大的N端膜外區(qū)和一個(gè)C端疏水錨定區(qū)組成，與HCV另一包膜蛋白E1通過(guò)非共價(jià)鍵形成異源性二聚體。E2蛋白是介導(dǎo)病毒吸附和進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白，是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生HCV中和抗體的關(guān)鍵抗原，因此是疫苗研究的最主要靶標(biāo)。然而，包膜蛋白高度變異，尤其E2蛋白氨基末端的含有27個(gè)氨基酸殘基的高變區(qū)1（hypervariable region1，HVR1）是HCV蛋白中變異

4、頻率最高的區(qū)域，也是公認(rèn)的HCV中和抗體表位所在區(qū)域。HVR1是介導(dǎo)HCV與受體SR-BI結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，HVR1與SR-BI的作用通過(guò)幾種不同的機(jī)制促進(jìn)HCV細(xì)胞侵入。HVR1抗體和SR-BI抗體均能阻斷HCV感染。HVR1的高度變異曾被認(rèn)為是遏制丙肝疫苗發(fā)展的瓶頸問(wèn)題，近幾年來(lái)基于HCV假病毒（HCVpp）以及細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的HCV（HCVcc）的中和試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HVR1并不是唯一的中和抗體表位所在區(qū)域，在HCV包膜E2蛋白中還存在一系

5、列構(gòu)象依賴的中和表位和線性中和表位，其中一些表位在不同基因型、亞型間高度保守。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期分別用分泌表達(dá)E2的表達(dá)質(zhì)粒以及刪除了HVR1的E2表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠，然后檢測(cè)、分析小鼠血清中的抗體以及病毒中和活性，結(jié)果顯示：E2質(zhì)粒免疫的小鼠血清中，HVR1抗體在總E2抗體中占很大比重，針對(duì)HVR1以外區(qū)域的抗體在中E2抗體中只占較小比重；刪除HVR1可顯著增強(qiáng)E2質(zhì)粒免疫誘導(dǎo)的針對(duì)HVR1以外區(qū)域的抗體，小鼠免疫血清與其他基

6、因型E2蛋白的交叉反應(yīng)以及對(duì)其他基因型HCVpp的交叉中和活性也隨之顯著增強(qiáng)。這和急性HCV感染者血清中可檢測(cè)到HVR1抗體而難以檢測(cè)到E2抗體相似。結(jié)果提示：HVR1有可能抑制E2蛋白中保守表位的免疫原性，從而從另一個(gè)方面導(dǎo)致HCV免疫逃避。目前基于HCV包膜蛋白為主要靶抗原的疫苗均含有HVR1，這類疫苗免疫黑猩猩只能抵抗同株病毒攻擊，但不能抵抗異株的攻擊。HVR1的存在可能是這類疫苗免疫保護(hù)效果不理想的重要原因，刪除HVR1也許能增

7、強(qiáng)疫苗免疫對(duì)異株病毒攻擊的保護(hù)效果。
　　 核酸疫苗在大動(dòng)物的免疫效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及在小動(dòng)物的免疫效果，目前還沒(méi)有核酸疫苗用于人類。為了進(jìn)一步探討用刪除了HVR1的包膜E2蛋白作為HCV疫苗的發(fā)展前景，本研究用CHO細(xì)胞表達(dá)了E2以及刪除了HVR1的E2蛋白，用親和層析純化出了兩種E2蛋白，分析兩種E2蛋白的構(gòu)象、受體結(jié)合功能和抗原性，通過(guò)小動(dòng)物免疫分析HVR1對(duì)E2蛋白免疫原性的影響，與我們用核酸免疫獲得的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比和驗(yàn)證，探討缺

8、失HVR1的E2蛋白在丙肝疫苗中的應(yīng)用前景。
　　 一、穩(wěn)定表達(dá)HCV包膜E2-人IgG Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞株的建立
　　 二、E2-Fc、E2Δ-Fc融合蛋白純化及功能鑒定
　　 三、刪除HVR1增強(qiáng)E2-Fc融合蛋白的免疫原性
　　 小結(jié)：本研究著眼于丙型肝炎病毒蛋白疫苗的開(kāi)發(fā)思路，在前期DNA免疫的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)E2-Fc/E2Δ-Fc的無(wú)蛋白無(wú)血清懸浮CHO細(xì)胞培養(yǎng)體系并成功純化出相