粘細菌來源的麥芽六糖淀粉酶AmyM高效表達及新糖化型淀粉酶AmyC的酶學性質(zhì)研究.pdf

1、α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)是一類能水解淀粉分子內(nèi)α-1，4和α-1，6糖苷鍵的水解酶類的總稱，其生成的產(chǎn)物一般都是具有α-異頭碳構型的糖類物質(zhì)。α-淀粉酶廣泛分布于植物（大麥、土豆、水稻和玉米等），動物（唾液和胰腺等）及微生物（細菌、真菌及放線菌）中，α-淀粉酶制劑已在酒精、淀粉糖、釀酒和變性淀粉等行業(yè)得到普遍應用，在工業(yè)生產(chǎn)中具有相當重要的地位。
　　本文對粘細菌來源的α-淀粉酶基因amyM進行了高效表達和酶學性質(zhì)研究

2、。在原核表達系統(tǒng)大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)和真核表達系統(tǒng)畢赤酵母Pichiapastoris GS115中對α-淀粉酶基因amyM均實現(xiàn)了異源表達，并對重組表達菌株Pichia pastoris GS115(pEFαA-amyM)進行了培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基的優(yōu)化，初步確定了搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的條件，采用了更加經(jīng)濟易得的糖蜜和葡萄糖作為發(fā)酵碳源。在50L發(fā)酵罐中實現(xiàn)了重組酶的高密度發(fā)酵，產(chǎn)酶量在誘導60 h后能達到

3、223 mg/L的酶量，基本滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。重組酶的酶學性質(zhì)穩(wěn)定，在以可溶性淀粉作為底物反應時主要生成的水解產(chǎn)物為麥芽六糖，占到總產(chǎn)物的54％以上;在高濃度的鹽溶液或乙醇環(huán)境中，該酶具有較高穩(wěn)定性，因此該重組酶AmyM具有良好的工業(yè)應用前景。
　　粘細菌來源的另一個α-淀粉酶基因amyC在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中成功實現(xiàn)異源表達，經(jīng)過Ni-NTA親和層析柱純化后，對該酶酶學性質(zhì)進行了研究。通過以可溶性淀粉為

4、底物的藍值快速下降現(xiàn)象和產(chǎn)物的旋光度測定確定其為內(nèi)切型的α-淀粉酶。以麥芽寡糖和可溶性淀粉等多糖類物質(zhì)為底物時，通過水解產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)該酶作用的主要產(chǎn)物為葡萄糖到麥芽四糖的混合物，該酶能作用的最小糖底物為麥芽三糖，屬于糖化型α-淀粉酶。底物譜實驗表明該酶能在水解α-1，4糖苷鍵的同時也能水解α-1，6糖苷鍵，對麥芽三糖的水解產(chǎn)物時間曲線顯示有四糖物質(zhì)的生成，分析其有轉糖苷的活性。重組酶AmyC的最適反應溫度為50℃，最適pH值為6.0，該