基于WAVE生物反應(yīng)器大規(guī)模懸浮微載體培養(yǎng)前列腺癌細胞PC-3條件優(yōu)化.pdf

1、目的:
　　通過轉(zhuǎn)瓶將PC-3細胞大量擴增，擴增得到的細胞轉(zhuǎn)入2L WAVE生物反應(yīng)器中進行大規(guī)模微載體懸浮培養(yǎng)。通過胰酶消化及細胞再次貼壁微載體在生物反應(yīng)器中實現(xiàn)微載體上細胞球轉(zhuǎn)球擴大培養(yǎng)。建立起一整套從轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)到生物反應(yīng)器中微載體懸浮培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)體系。為前列腺癌疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)提供技術(shù)支持。
　　方法:
　　1.轉(zhuǎn)瓶中貼壁培養(yǎng)PC-3細胞條件優(yōu)化。
　　在850cm2轉(zhuǎn)瓶中貼壁培養(yǎng)PC-3細胞，擴增細胞

2、數(shù)量，從而培養(yǎng)出足夠數(shù)量的細胞并在WAVE生物反應(yīng)器上進行大規(guī)模微載體懸浮培養(yǎng)。摸索轉(zhuǎn)瓶中貼壁培養(yǎng)的細胞接種密度，通過計數(shù)未貼壁的細胞密度來計算細胞在不同轉(zhuǎn)速下的貼壁率，從而得出在轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)速對于細胞貼壁及后續(xù)生長傳代的影響。實現(xiàn)細胞在轉(zhuǎn)瓶中擴大培養(yǎng)。
　　2.小規(guī)模微載體靜止培養(yǎng)PC-3細胞條件優(yōu)化。
　　在細菌培養(yǎng)皿中分別接種3×105cells/mL、5×105cells/mL及7×105cells/mL的細

3、胞密度，加入過量的微載體供細胞貼壁。每24h監(jiān)測葡萄糖濃度及細胞密度，根據(jù)葡萄糖代謝曲線及細胞生長速度，探索最適的細胞接種密度及在該密度下細胞培養(yǎng)模式、換液方式。在最佳細胞接種密度的基礎(chǔ)上選擇2g/L、3g/L、4g/L及5g/L的微載體濃度做對比實驗，從細胞增長情況對比判斷最佳微載體濃度。對比細胞在微載體上不經(jīng)胰酶消化直接加入新的微載體，通過細胞間的“橋聯(lián)”作用實現(xiàn)微載體上細胞球轉(zhuǎn)球擴大培養(yǎng)與消化10min、15min、20min、及

4、30min后再加入新的微載體使細胞重新貼壁的球轉(zhuǎn)球擴大培養(yǎng)效果。經(jīng)兩種放大培養(yǎng)方式處理后再培養(yǎng)四天，對比細胞生長速度及最后收獲的細胞數(shù)量，最終確定最佳的培養(yǎng)方案。為WAVE生物反應(yīng)器上大規(guī)模培養(yǎng)提供參考。
　　3.WAVE生物反應(yīng)器上大規(guī)模懸浮微載體培養(yǎng)PC-3細胞條件優(yōu)化。
　　在WAVE生物反應(yīng)器400mL培養(yǎng)體積條件下，以5×105cells/mL的初始細胞接種密度為基礎(chǔ)再一次探索3g/L、4g/L及5g/L微載體濃度

5、對細胞生長的影響，每24h對細胞進行抽樣，觀察細胞生長情況、檢測葡萄糖濃度，計數(shù)細胞并繪制細胞密度曲線。同時根據(jù)小規(guī)模培養(yǎng)時的消化結(jié)果，在WAVE生物反應(yīng)器中對細胞消化15及20min并加入新的微載體繼續(xù)培養(yǎng)，觀察不同的消化時間對于細胞后續(xù)貼壁及生長傳代的影響，并與不消化直接加微載體進行細胞球轉(zhuǎn)球擴大培養(yǎng)方式做對比，從而選擇最佳的細胞球轉(zhuǎn)球擴大培養(yǎng)方案，為大規(guī)模制備前列腺癌腫瘤疫苗奠定基礎(chǔ)。將培養(yǎng)結(jié)束后收獲的細胞固定，錨定GM-CSF與

6、TNF-a兩種蛋白制備成腫瘤疫苗并檢測疫苗的錨定率。
　　結(jié)果:
　　1.建立起轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)PC-3細胞的新方法，篩選出2×105cells/mL為最佳起始接種密度（在200mL的培養(yǎng)體積中細胞起始接種數(shù)量為4×107cells），并確立在轉(zhuǎn)瓶中連續(xù)培養(yǎng)4天的貼壁培養(yǎng)方式。探索出細胞貼壁的最佳起始轉(zhuǎn)速為4rph，根據(jù)先慢后快的貼壁細胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)模式[1]，在培養(yǎng)的第三天將轉(zhuǎn)瓶的轉(zhuǎn)速調(diào)整為6rph取得了良好的效果，培養(yǎng)四天后單個轉(zhuǎn)瓶

7、的細胞數(shù)量最高可達8-10×107cells。
　　2.在小規(guī)模微載體靜止培養(yǎng)條件下，根據(jù)葡萄糖濃度和細胞密度變化曲線，將5×105cells/mL作為細胞初始接種密度。同時根據(jù)不同微載體濃度對細胞生長的對比結(jié)果，選擇3g/L或4g/L作為最適微載體濃度。通過對不消化直接加入新載體與消化不同時間后再加入新微載體兩種細胞球轉(zhuǎn)球擴大培養(yǎng)方式的對比，最終確定在胰酶消化15或20min后再加入微載體更有利于細胞后續(xù)生長。
　　3.在

8、WAVE生物反應(yīng)器中，通過5度、8rpm擺動2min，靜止培養(yǎng)20min的循環(huán)培養(yǎng)模式進行微載體懸浮培養(yǎng)細胞。在5×105cells/mL起始細胞接種密度條件下，選擇3g/L的微載體濃度做為最適濃度。根據(jù)WAVE生物反應(yīng)器中胰酶消化后微載體球轉(zhuǎn)球擴大培養(yǎng)結(jié)果，最終選擇經(jīng)胰酶消化20min做為最佳消化時間，從而實現(xiàn)細胞在WAVE生物反應(yīng)器中微載體球轉(zhuǎn)球擴大培養(yǎng)。最終在2L生物反應(yīng)器中細胞密度達到1.3×106cells/mL，細胞總量可達