MiR-198、miR-203、miR-210、miR-34a對皮膚損傷修復過程中相關細胞功能影響的研究.pdf

1、研究背景：
　　皮膚損傷修復是通過表皮干細胞的分化及增殖實現(xiàn)的，典型的皮膚損傷修復開始于角質形成細胞從損傷邊緣的遷移，隨后的上皮再生過程還涉及損傷邊緣毛囊細胞的增殖及遷移?？偟膩碚f，損傷修復過程在某種程度上類似于發(fā)育，而且同腫瘤細胞具有相似的細胞生物學特性以及分子變化。在皮膚的眾多調控因子中，microRNA(miRNA)是非常重要的一種。MiR-198近來被發(fā)現(xiàn)作為一種腫瘤抑制因子在機體內(nèi)發(fā)揮調控作用，其通過抑制細胞的有絲分裂和

2、相關的運動通路實現(xiàn)對細胞增殖的抑制，但是miR-198在非腫瘤細胞或組織中對細胞增殖的抑制仍然少有研究。MiR-203是一種上皮組織特異性表達的miRNA，不僅參與皮膚發(fā)育，還具有抑癌和促凋亡作用。MiR-210是一種存在于多種組織細胞中的重要的缺氧相關miRNA，其表達廣泛參與了細胞的增殖、線粒體呼吸、DNA損傷修復、血管生成等病理生理過程。MiR-34a是目前研究較多的腫瘤相關miRNA。
　　研究目的：
　　皮膚染毒的

3、防治一直是芥子氣（硫芥）研究的重點。角質形成細胞，尤其是基底層的表皮細胞是硫芥作用的主要靶細胞。硫芥損傷皮膚的機制尚未完全研究清楚，還沒有見到miRNA參與硫芥損傷的研究。
　　研究方法：
　　1、研究硫芥染毒人永生化角質形成細胞HaCaT后，miR-198的表達變化。通過改變細胞內(nèi)miR-198的表達研究其對HaCaT細胞增殖及細胞周期的影響，通過生物信息學預測手段尋找miR-198新的可能的結合靶點，用熒光素酶報告基因進

4、行驗證，并研究該靶點是否參與細胞增殖及細胞周期調控。研究miR-198及其新靶點對HaCaT細胞的遷移和粘附能力的影響，利用生物信息學手段并結合實驗研究對mmu-miR-198進行預測和實驗驗證。
　　2、研究硫芥染毒HaCaT細胞以及SKH-1無毛小鼠后，miR-203在細胞及染毒皮膚組織中的表達改變。在細胞水平上，研究miR-203對細胞增殖和遷移能力的影響，及其應對硫芥損傷的能力。在動物模型中，研究miR-203的表達改變對

5、小鼠皮膚切割傷、硫芥染毒損傷修復的影響，以及miR-203的表達改變是否對硫芥造成的骨髓和腸道損傷具有保護效應。通過對臨床病例研究的收集整理，明確miR-203甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用，分析miR-203作為腫瘤病人診斷和預后生存時間的預測標志物的可能性。
　　3、研究硫芥染毒HaCaT細胞以及SKH-1無毛小鼠后，miR-210在細胞及染毒皮膚組織中的表達改變。在細胞水平上，研究miR-210對細胞增殖和遷移能力的影響。

6、在動物模型中，研究miR-210的表達改變對小鼠皮膚切割傷、硫芥染毒損傷修復的影響，以及miR-210的表達改變是否對硫芥造成的骨髓和腸道損傷具有保護效應。通過對臨床病例研究的收集整理，明確miR-210作為腫瘤病人預后生存時間的預測標志物的可能性。
　　4、通過對臨床病例研究的收集整理，明確miR-34a作為腫瘤病人預后生存時間的預測標志物的可能性。
　　研究結果：
　　1、硫芥染毒人永生化角質形成細胞HaCaT后，

7、miR-198的表達出現(xiàn)顯著上調。瞬時轉染miR-198進入HaCaT細胞抑制了細胞增殖，細胞周期阻滯于G1期。生物信息學預測顯示細胞周期蛋白D2(cycling D2，CCND2)是miR-198的一個新的靶點，熒光素酶報告基因檢測結果提示，miR-198可以直接結合在CCND2的3'非編碼區(qū)（3'-Untranslated Regions，3'-UTR），下調細胞內(nèi)CCND2的mRNA和蛋白表達。而細胞內(nèi)CCND2水平的下調顯著抑制

8、了細胞增殖，并導致了細胞周期的G1期阻滯。另外，miR-198促進了HaCaT細胞的遷移和粘附能力，而CCND2的下調并未顯示相同的促遷移作用。利用生物信息學手段對mmu-miR-198的預測沒有取得預期的結果。
　　2、MiR-203在硫芥染毒的HaCaT細胞內(nèi)表達變化并不顯著，但在硫芥染毒小鼠皮膚組織中，miR-203在染毒后的不同時間以及不同部位均出現(xiàn)了顯著的表達變化。miR-203在細胞水平上具有的促進細胞增殖和遷移的作用

9、可能參與了小鼠皮膚組織中表皮細胞的損傷修復。在硫芥染毒小鼠的皮膚內(nèi)上調miR-203的表達雖然并沒有顯著的促進皮膚損傷修復，但相應的下調miR-203的表達卻顯著的抑制了皮膚的損傷修復，而對于皮膚染毒的小鼠骨髓和小腸，miR-203的干預均出現(xiàn)了明顯的保護效應。臨床病例研究提示miR-203甲基化參與了部分腫瘤內(nèi)miR-203表達的變化，而基于目前的研究現(xiàn)狀，miR-203作為腫瘤病人診斷和預后生存時間的預測標志物，并不令人滿意。

10、>　　3、MiR-210在硫芥染毒的HaCaT細胞中表達出現(xiàn)顯著上調，過表達miR-210抑制了細胞的增殖和遷移，而抑制miR-210則出現(xiàn)相反的效應。硫芥染毒小鼠的皮膚組織中，miR-210的表達在損傷后的不同時間均出現(xiàn)顯著上調。在硫芥染毒的小鼠皮膚中下調miR-210的表達不僅顯著的促進了皮膚早期以及中期的損傷修復，也保護了染毒小鼠的骨髓和小腸。臨床的病例研究提示，miR-210在多種腫瘤組織中出現(xiàn)表達變化，其高表達預示了腫瘤病人較

11、差的預后生存時間。
　　4、MiR-34a在多種腫瘤組織中均有顯著的表達變化。多數(shù)的研究證實了其高表達可以預測腫瘤病人較好的預后生存，而也有部分研究提出了相反的結論。通過meta分析，miR-34a在部分腫瘤中的高表達可以預測腫瘤病人較好的預后生存。
　　研究結論：
　　硫芥染毒人永生化角質形成細胞HaCaT后，miR-198、miR-210的表達出現(xiàn)顯著上調，miR-203的表達變化不顯著。miR-198通過靶向CC

12、ND2抑制了HaCaT細胞的增殖，引起了細胞周期阻滯。MiR-203促進了染毒HaCaT細胞的存活，對細胞遷移也有一定影響。MiR-210抑制了HaCaT細胞的增殖以及遷移。硫芥染毒小鼠皮膚中，miR-203和miR-210都發(fā)生了顯著變化，下調miR-203抑制了小鼠皮膚的損傷修復，而下調miR-210則促進了小鼠皮膚的損傷修復。臨床病例分析提示，miR-210和miR-34a均是較為理想的腫瘤病人預后生存預測的生物標志物，而miR-