產(chǎn)酶溶桿菌第二信使C-dI-GMP合成相關基因lys385的克隆及功能分析.pdf

1、產(chǎn)酶溶桿菌（Lysobacter enzymogenes）屬于黃單胞科(Xanthomonadaceae)、溶桿菌屬(Lysobacter)，是一種不同于芽孢桿菌和假單胞桿菌的重要生防革蘭氏陰性細菌。該菌能產(chǎn)生多種胞外水解酶，包括幾丁質酶、纖維素酶和蛋白酶，以及小分子次生抗菌代謝產(chǎn)物，對植物病原真菌、卵菌和陽性細菌均有較好的抗菌活性。熱穩(wěn)定抗真菌因子HSAF和抗細菌物質WAP-89294A2是產(chǎn)酶溶桿菌產(chǎn)生兩種新型小分子抗菌物質，分別對

2、絲狀真菌和卵菌，以及革蘭氏陽性細菌具有廣譜抗菌活性。目前這兩種小分子抗菌物質在產(chǎn)酶溶桿菌體內的生物合成途徑已經(jīng)得到研究，但它們生物合成的遺傳調控機制并未完全解析。
　　環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)是細菌中的一種新型第二信使，由2分子GTP在具有GGDEF保守結構域的鳥苷酸環(huán)化酶(DGCs)的催化下合成，并可被含有EAL或HD-GYP結構域的磷酸二酯酶(PDEs)降解。已研究報道的DGCs和PDEs，通常都在N端存在一個或多個與信

3、號接收與傳遞相關的結構域（如PAS和GAF等）。當這些結構域感應胞內外某種或某些信號后，會激活或抑制相應PDEs或DGCs的活性，從而改變胞內c-di-GMP含量，進而通過c-di-GMP下游特異的受體來調控細菌一系列重要的生理生化功能，如細菌的運動性、生物膜形成以及致病性。該第二信使在生防細菌抗菌產(chǎn)物生物合成中的調控功能研究只在革蘭氏陽性細菌中被報道，在革蘭氏陰性細菌中缺乏相應的研究。
　　本研究以具有自主知識產(chǎn)權的產(chǎn)酶溶桿菌菌

4、株OH11為對象，旨在解析c-di-GMP介導的信號途徑在小分子抗菌物質HSAF和WAP-8294A2生物合成中的功能。本研究通過全基因組掃描，鑒定了1個與c-di-GMP合成相關的基因，命名為Lys385。Lys385蛋白的N端含有一個cNMP結合結構域，推測其在產(chǎn)酶溶桿菌細胞內能結合某種核苷酸;其C端含有1個GGDEF結構域，推測其具有DGCs活性，參與c-di-GMP的合成。為探索該基因在HSAF和WAP-8294A2生物合成中調

5、控功能，我們利用基因同源重組原理，構建了lys385的框內缺失突變體，同時構建了相應的互補菌株及過表達菌株。定量檢測結果表明:lys385的缺失不影響HSAF和WAP-89294A2的產(chǎn)量，推測在所測條件下該基因并不參與HSAF和WAP-8294A2的生物合成，但是過表達菌株可提高HSAF產(chǎn)量。同時，在HSAF和WAP-8294A2的產(chǎn)生條傳下，lys385的缺失或過量表達也不改變產(chǎn)酶溶桿菌對植物病原真菌（水稻紋枯病菌）的抗菌活性。為探