組成型過量表達hTERT對Vero細胞體外培養(yǎng)生物學特性的影響.pdf

1、Vero細胞是WHO和我國生物制品規(guī)程認可使用的人用疫苗生產(chǎn)細胞系。Vero細胞廣泛的病毒感染譜、高效的病毒擴殖效率、無致瘤性和便于迅速擴大培養(yǎng)等優(yōu)勢使其成為目前世界人用疫苗生產(chǎn)領域應用最廣泛的細胞株之一。但是，Vero細胞自身高度的貼壁性和對血清的依賴以及在生物反應器中的大量凋亡等缺陷也嚴重制約著現(xiàn)行的疫苗生產(chǎn)工藝。
　　 端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT

2、)被認為是端粒酶的重要組成部分和限速因子。越來越多的證據(jù)顯示，hTERT除參與形成端粒酶復合物、延長端粒長度和保證細胞分裂過程中的基因組穩(wěn)定性之外，可以有效減少惡劣培養(yǎng)環(huán)境帶來的細胞凋亡，提高細胞的生存能力。組成型過量表達hTERT是值得關注和探索的改善細胞培養(yǎng)特性、提高哺乳動物表達系統(tǒng)質量的有效技術途徑。
　　 本課題的研究目標是建立能夠穩(wěn)定高水平表達hTERT的Vero細胞系，考察過表達hTERT及不同的hTERT表達水平對

3、Vero細胞體外培養(yǎng)生物學特性帶來的影響。
　　 以EGFP為報告基因，借助流式細胞分析驗證了真核表達載體phEF-ChMAR-hyg在Vero細胞的表達效果，構建了hTERT高效表達載體phEF-ChMAR-hyg-hTERT。采用RT-PCR和Real-Time PCR分析phEF-ChMAR-hyg-hTERT轉染陽性細胞克隆hTERT mRNA的表達水平，從中選取hTERT mRNA相對表達水平是野生型Vero細胞的35

4、.26倍和6.14倍的hTERT組成型過量表達Vero細胞系，T1和T3。采用Western Blot分析和TRAP-PCR的方法驗證了hTERT mRNA、蛋白水平和功能表達的一致性及T1、T3細胞組成型過量表達hTERT的穩(wěn)定性。
　　 以活細胞密度和細胞活力為主要觀察指標，結合細胞形態(tài)和貼附伸展動態(tài)，考察hTERT組成型過量表達Vero細胞T1和T3在靜止貼附培養(yǎng)、微載體固定化培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)體系中的細胞生長。hTERT的組

5、成型過量表達在降低Vero細胞的貼附伸展能力的同時，賦予了T1和T3細胞，尤其是T1細胞非貼附依賴性生長的能力。同時，hTERT的組成型過量表達降低了Vero細胞體外培養(yǎng)對血清的依賴程度，提高了細胞批次培養(yǎng)后期的細胞活力和活細胞密度。
　　 以葡萄糖比消耗速率(qGlu)、乳酸比生成速率(qLac)、乳酸轉化率(YLac/Glu)和谷氨酰胺比消耗率(qGln)為反映細胞代謝的主要觀察指標，考察T1、T3細胞和野生型Vero細胞在