人源半乳糖凝集素類似蛋白GRP的結(jié)構(gòu)與功能研究及人源gal-8的初步晶體學(xué)研究.pdf

1、(Ⅰ)凝集素是自然界廣泛存在的一人類非免疫來源的、無酶活性的多價(jià)的糖類結(jié)合蛋白質(zhì)，能使細(xì)胞發(fā)生凝集。凝集素可從不同的角度來分類，根據(jù)來源可分為動(dòng)物凝集素、植物凝集素和微生物凝集素。半乳糖凝集素galectin為S型動(dòng)物凝集素，它廣泛存在于各種動(dòng)物體內(nèi)，galectin家族成員具有高度保守的特征性的氨基酸序列，擁有一個(gè)大約130個(gè)氨基酸的核心序列，通常稱之為糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(CRD：carbohydrate recognition domai

2、n)，能特異性地結(jié)合β-半乳糖苷，且進(jìn)化保守，種類繁多，功能復(fù)雜，可能參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞間質(zhì)之間的相互作用，細(xì)胞粘附、凋亡及免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)過程。 根據(jù)分子結(jié)構(gòu)，目前galectin可劃分為3種基本類型：1)原型galectin (Prototype：含有單一的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域CRD)： 2)嵌合型galectin(Chimera：一個(gè)CRD與一個(gè)膠原蛋白樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域融合)； 3)前后重復(fù)型galectin (Tande

3、m-repeat：兩個(gè)CRD串聯(lián)融合)。原型galectin包括：galectin-1，2，5，6，7，10，11，13，14，15等；嵌合型galectin儀有一個(gè)成員galectin-3；前后重復(fù)型galectin包括galectin-4，6，8，9，12。在過去的一些年里，半乳糖凝集素家族的一些蛋白的晶體結(jié)構(gòu)逐漸被解析出來。迄今為止，gal-1， gal-2，gal-3， gal-7， gal-9的N端結(jié)構(gòu)域以及gal-10等的晶

4、體結(jié)構(gòu)已經(jīng)投入PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中。從這些已經(jīng)報(bào)道的晶體結(jié)構(gòu)來看，它們都采取了類似的大豆凝集素的凝膠卷拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。它們的保守CRD結(jié)構(gòu)域包含由11或12條β-strand的雙層β-sheet組成的β-三明治結(jié)構(gòu)，其中一些蛋白含有短的3<,10>螺旋。這些已知晶體三維結(jié)構(gòu)的蛋白中，糖結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)特征也比較相似，以Gal-1-V-galactoside復(fù)合體為例，蛋白與糖配體的結(jié)合主要靠His44，Asn46，Arg48，Val59，Asn

5、61，Trp68，Glu71和Arg73等氨基酸殘基直接與結(jié)合的二糖相互作用。 GRP(即：HSPC159)是個(gè)新的人類galectin相關(guān)基因，最近通過測定人的造血干細(xì)胞CD34+全長的mRNA序列得到鑒定。盡管它編碼的蛋白質(zhì)含有一個(gè)比普通稍長的N端序列，但仍可以被劃歸到“原型”galectin。它的序列中不含有公認(rèn)的分泌或者核定位信號(hào)肽序列。人類的GRP基因定位于染色體2P13上，包含有5個(gè)外顯子，含有在galectin家族

6、中保守的外顯子和內(nèi)含子連接處。GRP的序列在進(jìn)化上非常古老并且在不同的物利中高度保守，非常相似的cDNA序列已經(jīng)在人類、鼠、雞、青蛙和魚當(dāng)中發(fā)現(xiàn)。GRP含有其它galectin最保守的64個(gè)殘基中的51個(gè)，是一個(gè)galectin相關(guān)蛋白質(zhì)。然而，像GRIFIN一樣，GRP的序列只具有那些保守的糖識(shí)別殘基中的2個(gè)，因此可能不結(jié)合半乳糖苷。GRP的生物功能目前還不清楚。在本論文中，我們構(gòu)建表達(dá)并純化了人源GRP的C端保守結(jié)構(gòu)域CRD(氨基酸

7、殘基38-172)，然后我們使用懸滴氣相擴(kuò)散的方法長出了它的晶體。在北京和合肥同步輻射實(shí)驗(yàn)室收集到了最高分辨率達(dá)1.8A的衍射數(shù)據(jù)。晶體有兩個(gè)空間群，分別是C2空間群，晶胞參數(shù)是：a=123.07，b=96.67，c=61.56 A，β=118.72°；F222空間群，晶胞參數(shù)是：a=96.89，b=127.76，c=213.29，α=β=γ=90°。計(jì)算的Matthews coefficient分別為2.6 A<'3>/Da對(duì)應(yīng)518

8、％的溶劑含量，和2.55 A<'3>/Da對(duì)應(yīng)52.5％的溶劑含量。然后，我們使用分子置換的方法解析了GRP-C的晶體相位并通過精修得到了1.9 A的三維結(jié)構(gòu)模型。GRP采用了和半乳糖凝集素類似的折疊方式即由兩個(gè)反向平行的β-sheet組成的β-三明治結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-sheet為主，此外還含有一個(gè)小的3<,10>螺旋。GRP蛋白的晶體堆積方式非常獨(dú)特，它的不對(duì)稱單位中含有4個(gè)分子，先兩兩形成一個(gè)含有一個(gè)非晶體學(xué)對(duì)稱軸的同源二聚體，然

9、后這兩個(gè)二聚體垂直排列并且以凹面相對(duì)，形成中間帶有一個(gè)圓孔的四體結(jié)構(gòu)。糖結(jié)合試驗(yàn)和共結(jié)晶試驗(yàn)以及對(duì)晶體結(jié)構(gòu)的分析表明GRP確實(shí)不具有結(jié)合糖配體的能力。它的功能作用方式與凝集素存在著根本的不同。因此我們又根據(jù)蛋白的表面電荷分布情況推測了GRP可能的在體內(nèi)發(fā)揮生理功能的方式即通過親水和疏水相互作用進(jìn)行特異性識(shí)別以及通過與金屬離子的結(jié)合來發(fā)揮生物學(xué)功能。 galectin相關(guān)蛋白(Ⅱ) Galectin-8屬于前后重復(fù)型凝集素亞家族。它

10、包含有一些異構(gòu)體，每個(gè)異構(gòu)體都由兩個(gè)140個(gè)左右氨基酸殘基長的結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都包含有一個(gè)糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域由一個(gè)長度不等的連接肽連接起來。人的galectin-8包含33kbp的基因組DNA，定位于染色體1q42.11上，包含11個(gè)外顯子。基因通過可變剪接共產(chǎn)生14個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，編碼6個(gè)蛋白。像其它凝集素一樣，galectin-8是一個(gè)分泌蛋白。通過分泌，galectin-8扮演細(xì)胞粘結(jié)的生理調(diào)控因子的角色。當(dāng)它不固定時(shí)，

11、作為基質(zhì)蛋白發(fā)揮生理功能，等同于纖維粘連蛋白通過連接和聚集一些特定的細(xì)胞表面整合素受體來刺激細(xì)胞粘附。Galectin-8和整合素復(fù)合物的形成包含糖一蛋白相互作用并引發(fā)了整合素介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反映例如FAK和paxillin的酪氨酸激酶的磷酸化。相反，當(dāng)galectin-8作為過剩的可溶配體時(shí)，像纖維粘連蛋白一樣，它能與整合素形成復(fù)合物負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附。這樣的一個(gè)機(jī)制使得分泌的galectin-8發(fā)出的本地信號(hào)可以傳到細(xì)胞粘附和遷移的特定區(qū)

12、域。由于它對(duì)細(xì)胞粘附的雙重作用和它與纖維粘連蛋白的聯(lián)系，galectin-8可以被看作一種新型的細(xì)胞基質(zhì)蛋白。Galectin-8的表達(dá)水平與某些人類腫瘤、前列腺癌正相關(guān)。過量表達(dá)的凝集素可以刺激那些腫瘤組織的生長和轉(zhuǎn)移，這也是靠它的調(diào)節(jié)細(xì)胞粘結(jié)和生長的能力來完成的。因此，galectin-8可以調(diào)控細(xì)胞一基質(zhì)的相互作用，也可以調(diào)節(jié)多種生理和病理環(huán)境下的細(xì)胞功能。在本研究中，我們表達(dá)并純化了人源galectin-8以及它的C末端保守結(jié)構(gòu)

13、域CRD。然后運(yùn)用懸滴氣相擴(kuò)散的方法結(jié)晶了CCRD蛋白。蛋白的結(jié)晶條件是：27.5％PEG8000， 100mM Na Cacodylate buffer pH6.5，0.2M ammonium phosphate， 5％Ethylene Glycol。晶體在實(shí)驗(yàn)室銅靶光源100K的溫度下收集了一套3 A的常規(guī)衍射數(shù)據(jù)。品體屬于正交品系，空間群為P222，晶胞參數(shù)為a=54.15，b=73.13，c=179.42 A。計(jì)算得到的Matt