油菜自交不親和基因BnSCR1和BnSRK1保守性及其啟動(dòng)子調(diào)控分析.pdf

1、自交不親和性是開花植物抑制自交、促進(jìn)異交的自然現(xiàn)象，是雜種優(yōu)勢(shì)利用的重要途徑。已有研究表明，花粉端SP11/SCR(S-locus protein11or S-locus Cys-rich protein)與柱頭端SRK(S-locus receptor kinase)相互識(shí)別及SRK下游信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致甘藍(lán)型油菜自交不親和性。本文研究蕓薹屬BnSCR1-BnSRK1-BnARC1自交不親和信號(hào)通路在擬南芥中的保守性，自交不親和系“W-3”

2、的BnSCR1基因和BnSRK1基因啟動(dòng)子順式作用元件及反式調(diào)控因子，為進(jìn)一步揭示甘藍(lán)型油菜自交不親和機(jī)理、蕓薹屬自交不親和信號(hào)路徑奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下。
　　1.構(gòu)建pORE_O4-BnSCR1+BnSRK1和pORE_O4-BnSCR1+BnSRK1+BnARC1兩種過表達(dá)載體，分別導(dǎo)入Col-0和C24兩種生態(tài)型擬南芥，獲得Col-0和C24過表達(dá)BnSCR1+BnSRK1轉(zhuǎn)基因植株21株和13株，Col-0和C24過表達(dá)

3、BnSCR1+BnSRK1+BnARC1轉(zhuǎn)基因植株12株和9株。通過授粉試驗(yàn)觀察、角果長(zhǎng)度和每角果粒數(shù)考察及外源基因表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所有轉(zhuǎn)基因植株自交親和，說明在擬南芥Col-0和C24中，蕓薹屬自交不親和信號(hào)通路BnSCR1-BnSRK1-BnARC1不起作用。
　　2.克隆了BnSRK1基因2kb啟動(dòng)子序列;啟動(dòng)子分析表明，PR1-GUS（-1809～-1bp）和PR2-GUS（-1314～-1bp）能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因在柱頭中表

4、達(dá);啟動(dòng)子缺失分析結(jié)果表明，調(diào)控BnSRK1基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域位于-1314～1000bp。克隆了Ⅱ類S單倍型的BnSCR-1300基因翻譯起始位點(diǎn)上游504bp啟動(dòng)子和BnSCR-6基因翻譯起始位點(diǎn)上游416bp啟動(dòng)子，啟動(dòng)子分析表明60P-GUS(-504～-1bp)和15P-GUS(-416～-1bp)均能驅(qū)動(dòng)GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥花藥發(fā)育的第9期至11期的絨氈層表達(dá)。
　　3.通過酵母單雜交實(shí)驗(yàn)獲得了與BnSCR1基

5、因684bp啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子BnPHL2α。兩輪誘餌序列截短實(shí)驗(yàn)表明BnPHL2α與p16X-3-AbAi的16bp(TTTAATTTCTTGCATA)序列互作。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明BnPHL2α定位在細(xì)胞核中。利用AH109酵母菌株沒有檢測(cè)到BnPHL2α的轉(zhuǎn)錄活性;通過BnPHL2α轉(zhuǎn)錄激活/抑制結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)BnPHL2α存在兩個(gè)保守區(qū)域（位于136-185aa的MYB CC結(jié)構(gòu)域、37-90aa的MYB DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域）可能

6、是該蛋白的抑制區(qū)域。雙熒光素酶報(bào)告(Dual luciferase reporter，DLR)系統(tǒng)檢測(cè)BnPHL2α基因?qū)nSCR1啟動(dòng)子P342活性表明，BnPHL2α基因抑制P342啟動(dòng)子的活性;P342啟動(dòng)子區(qū)域（-310至-295bp）序列(TTTAATTTCTTGCATA)的一系列突變實(shí)驗(yàn)表明，BnPHL2α對(duì)BnSCR1啟動(dòng)子P342活性調(diào)控的抑制位點(diǎn)位于-310至-295bp區(qū)域。EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，BnPHL2α蛋白能夠