通過MLPK，SLG基因調控表達控制甘藍自交不親和性的研究.pdf

1、自交不親和性是顯花植物在長期進化過程中，雌蕊的柱頭或者花柱可以辨別自體和異體花粉，阻止自體受粉而利于異花授粉，從而保持高度雜合性促進遠緣繁殖時產生的一種重要生殖機制。SI現(xiàn)象在顯花植物中非常普遍，生產中利用不同單倍型的自交不親和系進行雜種配制，是蕓薹屬植物雜交育種的重要方式。甘藍作為世界上重要的十字花科蔬菜作物，也是我國秋冬季重要的葉菜類蔬菜作物。自交不親和性是甘藍雜種生產的重要途徑，具有雜種優(yōu)勢較強、選育易、周期短等優(yōu)點。目前，甘藍自

2、交不親和系的選育和繁殖主要采用蕾期人工剝蕾授粉，該方法操作麻煩、效率低、費工費時、制種成本高，大大降低了甘藍雜種生產的經濟效益。因此，如何實現(xiàn)自交不親和系的簡便繁殖成為甘藍育種家們一直期望解決的問題。包括化學、物理、生物學及機械等方法被用于克服自交不親和以實現(xiàn)花期自交授粉。如花期噴灑一定濃度的Nacl溶液和硼酸，電刺激，高溫處理，混合花粉授粉，CO2處理，γ射線輻射，鋼刷授粉等。這些方法雖然能夠在一定程度上提高甘藍自交結實率，但是這些方

3、法操作復雜易使柱頭受傷，田間操作難度大。隨著自交不親和性遺傳機制及其分子機理越來越明晰，利用現(xiàn)代分子生物學手段，有望從根本上解決自交不親和的調控問題。為進一步研究自交不親和關鍵因子對自交不親和性的影響，開發(fā)甘藍自交不親和性人工調控生物技術手段，本研究通過農桿菌介導轉化法將柱頭特異啟動子SLR驅動下的反義MLPK基因和在柱頭特異啟動子SLG13驅動下的SLGi基因導入自交不親和甘藍材料‘TF’，通過反義干擾MLPK基因和RNA干擾SLG基

4、因的表達，研究MLPK和SLG在自交不親和信號傳導過程中的作用及功能，為解析MLPK和SLG基因參與蕓薹屬SI信號傳導的機制提供直接或間接的試驗證據。另外，將Cre/loxp重組系統(tǒng)和AlcR/alcA乙醇誘導基因表達系統(tǒng)相結合，構建了一套基于乙醇誘導表達的甘藍自交不親和性人工調控系統(tǒng)，實現(xiàn)甘藍自交不親和系的簡便繁殖和F1制種應用。本研究主要內容包括：
　?、艠嫿艘訠ar基因為篩選標記的植物表達載體pCABarMLPK，通過農桿

5、菌介導法將其導入自交不親和甘藍‘TF’中。花期柱頭MLPK基因的表達顯示，轉基因甘藍植株花期柱頭內源MLPK mRNA積累量明顯低于野生型對照植株。花粉原位萌發(fā)的熒光顯微觀察結果顯示，轉基因甘藍植株花期自交后，吸附在柱頭上的花粉粒大量萌發(fā)，且穿過柱頭的花粉管明顯增加，并導致花期自交結籽數量上升，轉基因植株花期和蕾期自交親和指數均明顯高于野生型對照植株。試驗結果表明，下調MLPK基因表達能部分打破甘藍自交不親和，提高其花期自交結籽能力。<

6、br>　?、仆ㄟ^農桿菌介導轉化法將pCABarSLGi載體導入高度自交不親和甘藍材料‘TF’?；ǚ墼幻劝l(fā)熒光顯微觀察結果顯示，轉基因甘藍植株花期自交授粉后大量花粉粒被吸附于柱頭表面并萌發(fā)，可見明顯的花粉管束穿過柱頭，導致花期自交結籽數量增加，其花期自交親和指數在1.03～13.96之間，顯著高于花期自交親和指數為0.06的野生型對照植株。熒光定量PCR分析顯示，轉基因甘藍植株花期柱頭中的SLG基因mRNA積累量顯著低于非轉基因野生型植

7、株。結果表明，干擾內源SLG基因的表達，對打破甘藍自交不親和性有積極作用，可導致花期自交結籽能力大幅度上升。
　　⑶將組合有Cre/loxp重組系統(tǒng)和AlcR/alcA乙醇誘導基因表達系統(tǒng)以及SLGi干擾結構的植物表達載體pCABaralcRSLGi，通過農桿菌介導轉化法導入高度自交不親和甘藍材料‘TF’?；ǚ墼幻劝l(fā)熒光顯微觀察結果顯示，轉基因植株花期白交可見大量花粉粒被吸附于柱頭表面并大量萌發(fā)形成花粉管束穿過柱頭。轉基因植株花

8、期自交后親和指數在0.66～14.7之間，均顯著高于野生型對照植株。熒光定量PCR分析結果顯示，轉基因甘藍植株在花期柱頭中的SLG基因mRNA積累量顯著低于非轉基因野生型植株mRNA積累量，并可在柱頭中檢測到alcR基因的表達。對pCABaralcRSLGi-5 T1代轉基因植株用1％～5％濃度的乙醇進行灌根處理，顯示5％濃度的乙醇誘導能夠高效刪除SLG-RNAi基因干擾表達盒。進一步對5個不同的pCABaralcRSLGi轉基因單株后

9、代群體利用5％的乙醇處理三次，結果顯示，僅17號單株T1代植株獲得高達60％的刪除效率，其余單株后代在同樣處理條件下刪除效率較低，刪除不完全導致嵌合體產生?；趐CABaralcRSLGi-5的后代單株乙醇誘導后Bar基因、alcR基因以及Cre基因表達隨誘導時間的變化結果顯示，隨著乙醇誘導時間的增加，Bar基因mRNA積累量逐漸增加，而alcR基因因不斷刪除，其mRNA積累量逐漸下降，與此同時，Cre基因的mRNA在乙醇施加初期大量積