稻曲病菌突變體庫的構建及其HOG1基因的克隆和功能初步分析.pdf

1、稻曲病菌是水稻重要的致病真菌，引起的稻曲病是水稻上的重要穗部病害。研究表明，許多植物病原真菌的生長、發(fā)育及致病性都受到細胞信號轉導途徑的調控，其中MAPK(mitogen-activated protein kinase)信號轉導途徑是普遍存在的并有重要調控作用的信號轉導途徑。深入研究稻曲病菌發(fā)育、致病分子機理對于防治稻曲病有著重要意義。
　　 本文建立了農桿菌介導的稻曲病菌轉化技術，成功獲得兩個生長缺陷突變體T18和T39，從

2、中鑒定和分析了T18的T-DNA插入標記的基因。本文還通過同源克隆的方法克隆了稻曲病菌HOG1基因，并對其功能進行初步的分析。主要結果如下:
　　 1.應用實時熒光定量PCR技術，分析了18S核糖體RNA基因（18S rRNA）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)、多聚泛素酶基因（ubiquitin）、β-肌動蛋白基因（β-actin）、α微管蛋白基因(α-tubulin)等5個基因的表達情況。經geNorm軟件統計學分析處

3、理，結果表明，當利用熒光定量PCR分析比較稻曲病菌基因表達差異時，可選擇α-tubulin和β-actin作為內參基因。
　　 2.通過優(yōu)化各種轉化條件，建立了根癌農桿菌介導稻曲病菌的高效遺傳轉化體系。本研究采用此轉化體系構建了含有1000多個轉化子的稻曲病菌T-DNA插入突變體庫，為以后的稻曲病菌基因功能研究奠定了一定的基礎。本研究通過形態(tài)觀察篩選出2株變異較大的突變菌株T18和T39，這兩個突變菌株在生長速度、產孢量、孢子萌

4、發(fā)率等方面與野生型相比存在明顯缺陷。另外，利用TAIL-PCR技術對T18側翼序列進行擴增得到約1800 bp右邊界序列，比對和預測結果表明該插入為點為細胞色素c氧化酶V的啟動子區(qū)域，但該基因的具體功能還需進一步的研究。
　　 3.根據幾種絲狀真菌Hog1 MAPK的保守氨基酸序列設計簡并引物，從稻曲病菌中擴增出MAPK同源基因的部分片段，然后利用RACE法延伸該片段的側翼序列，獲得MAPK編碼基因的全長序列，命名為UvHog1

5、。序列分析表明，該基因編碼358個氨基酸的多肽，推測分子量為40.98kDa，等電點為5.63。UvHog1含有MAPK保守的蛋白激酶激活域(TGY)，序列與稻瘟病MgOsml(AAF09475.1)、球孢白僵菌BbHog1(AAS77871.1)、煙曲霉AfOsm1(XP752664.1)和隱球酵母CrHog1(AAM26267.1)等Hog1 MAPK高度同源，相似性分別為95％、93％、88％和81％。系統聚類結果表明，UvHog